[发明专利]抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法

摘要

本发明公开了抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，通过分子生物学技术，选择表达载体pHT43构建重组表达载体，成功构建了重组表达载体pHT43/CC34，将重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，得到表达工程菌pHT43/CC34/WB800N。在LB培养基中，经IPTG诱导表达，表达产物采用高效液相色谱法(HPLC)纯化，得到CC34蛋白，利用质谱法(MS)检测其正确性。本发明方法在枯草芽孢杆菌WB800N中表达了抗菌肽CC34，分离纯化简单，易操作。表达产物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性，对有益菌无抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、饲料添加剂以及养殖领域。

主权项

抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建S11、设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列F1：5′‑GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA‑3′R1：5′‑ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC‑3′F2：5′‑GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG‑3′R2：5′‑TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC‑3′S12、将引物F1与R1、F2与R2分别进行延伸，得到延伸液P1、P2。具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2×Taq MasterMix 25μL、上游引物F1(10μM)2μL、下游引物R1(10μM)2μL、RNase‑Freewater 21μL加入到PGR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸2min，得延伸液P1。重复以上工艺，得延伸液P2；S13、以第一次PCR得到的延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR，具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2×Taq MasterMix 25μL、P1 0.5μL、P2 0.5μL、RNase‑Freewater 24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸5min，得抗菌肽基因；S14、将所得的抗菌肽基因与克隆载体pMD18‑T载体连接，在0.2mL微量离心管中，加入pMD18‑T Vector 1μL，胶回收后的抗菌肽基因2μL，ddH₂O2μL，Solution 1(冰上融化)5μL，全量为10μL；混合均匀，瞬时离心后，置于连接仪中，4℃，12h，得pMD 18‑T/CC34；S15、将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mL Cm的LB培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与‑20℃保存的鉴别正确的克隆质粒分别进行双酶切，酶切体系如下：Xbal 1μL、Saml 1μL、质粒DNA 10μL、CutSmart Buffer 2μL、灭菌的双蒸水6μL；酶切反应条件为：37℃水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、pMD‑18T/CC34质粒；S16、取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37℃水浴3h后，酶切反应完全；S17、将酶切好的CC34基因片段和酶切后的质粒pHT43进行连接，即可构建成质粒载体pHT43/CC34，连接反应体系如下：CC34基因6μL、10×T4DNAl igase Buffer 1μL、质粒pHT43 2.5μL、T4 DNA I igase 0.5μL；连接反应条件为：16℃水浴，过夜；S2、重组表达载体pHT43/CC34转化到宿主细胞中，构建三种表达工程菌菌株；S3、将步骤S2得到的表达工程菌以IPTG为诱导剂表达，获得表达产物；S4、分离纯化步骤S3所得的表达产物，获得抗菌肽蛋白CC34，并检测其正确性。