[发明专利]组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞高拟体内细胞外基质附着体外筛选培养方法

摘要

本发明公开了角质形成细胞的培养、筛选、扩增技术，这些瓶颈一直是生物学细胞领域研究热点和难点，目前利用基底膜显著黏附特性进行分离纯化，采用三维培养扩增手段获得。该发明适合依赖扩增贴壁型细胞并提供三维高拟体内细胞外基质系统进行目标细胞水平的筛选与分离。高模拟体内贴附环境，体外培养成体(胚胎皮肤)皮肤细胞的生物细胞新培养技术。高模拟底物所在环境黏附筛选培养目标角质形成细胞，具有高传代能力，高增殖能力，并可在体外环境下形成皮层结构。筛出免疫原性细胞安全获得免疫逃逸，延长移植时间增加组织工程临床应用，促进创面愈合与皮肤疾病提供了绝对优势临床治疗级细胞的解决方案。

主权项

一种用于筛选和培养组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞的培养基组合，其特征在于，其包括：培养液A：灭活胎牛血清40～60ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1×10^‑4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～4μg/ml、CaCl₂0.2～0.3mmol/l、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基DMEM/F12(3:1)或K‑SFM，定容到500ml；其中，采用K‑SFM时，所述EGF为5～8ng/ml；培养液B：灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10^‑4/L、胰岛素2～3μg/ml、EGF5～25ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1～3mg/L、CaCl₂0.1～0.3mmol/l、氢化可的松0.3μg/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、维生素C1～3μg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1：1)或K‑SFM，定容到500ml，PH控制在7.2～7.4；其中，采用K‑SFM时，所述EGF为5～6ng/ml；培养液C:灭活胎牛血清30ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10^‑4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素4～6μg/ml、EGF5～25ng/ml、bFGF10～18ng/ml、牛脑垂体提取物BPE1.5～3mg/L、CaCl₂0.2～0.4mmol/l、干细胞生长因子SCF5～15ng/ml、氢化可的松0.3μg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1：1)或K‑SFM，定容到500ml，PH7.2～7.4，其中，采用K‑SFM时，所述EGF为5ng/ml。