[发明专利]一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用

摘要

本发明公开了一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用。本发明提供了一种制备核糖体的方法，包括步骤(a)；所述步骤(a)为制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：(a1)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离心收集上清液；所述高压为500bar以上的压力；(a2)取步骤(a1)得到的上清液，通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白，然后离心收集上清液；所述“通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白”中的硫酸铵浓度为1.5M。本发明制备的嗜热栖热菌来源的核糖体纯度高并且结构完整，可用于嗜热菌体外无细胞翻译体系，用于各类嗜热蛋白的体外表达以及中温蛋白质的热稳定性进化方面的研究。

主权项

1.一种制备核糖体的方法，包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)；所述步骤(a)为制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：(a1)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离心收集上清液；所述高压为500bar以上的压力；所述步骤(a1)中，将所述微生物悬浮于菌体悬浮液并加入DNaseI，然后进行所述高压细胞破碎；所述菌体悬浮液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris‑HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl2、150mM KCl和7mM β‑mercaptoethanol；(a2)取步骤(a1)得到的上清液，通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白，然后离心收集上清液；所述“通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白”中的硫酸铵浓度为1.5M；所述步骤(b)为：取步骤(a2)得到的上清液，通过HiTrap Butyl FF疏水层析柱纯化核糖体；所述步骤(b)中，纯化核糖体的方法如下：取步骤(a2)得到的上清液，过滤除菌后上样于HiTrap Butyl FF疏水层析柱，用溶液Ⅱ进行洗脱并收集洗脱峰；所述溶液Ⅱ由1体积份缓冲液A和1体积份缓冲液B组成；所述缓冲液A如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris‑HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl2、150mM KCl、1.5M(NH4)2SO4和7mM β‑mercaptoethanol；所述缓冲液B如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris‑HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl2、150mM KCl和7mM β‑mercaptoethanol；所述步骤(c)为：取步骤(b)收集的溶液，通过蔗糖梯度离心纯化核糖体；所述步骤(c)中，纯化核糖体的方法如下：取离心管，先加入1体积份蔗糖缓冲液，然后加入1体积份步骤(b)收集的溶液，使两者之间形成分界面；然后取所述离心管，放入超离心转子中，离心取沉淀；所述蔗糖缓冲液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris‑HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl2、150mM KCl、7mM β‑mercaptoethanol和质量百分含量为30％的蔗糖；所述微生物为嗜热栖热菌。