[发明专利]牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

摘要

本发明公开了牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，首先设计出4条待选的shRNA序列以及1条阴性对照序列，构建RNA干扰载体，然后转染到奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中，最后利用实时荧光定量PCR和Western Blotting技术分别检测PSMA5在奶牛乳腺上皮细胞中mRNA和蛋白水平的表达。本发明构建了PSMA5基因RNA干扰载体，转染奶牛乳腺上皮细胞，并利用实时荧光定量PCR及western blotting的方法分别在mRNA和蛋白水平检测PSMA5基因的表达情况，为进一步揭示PSMA5在乳腺的CLA内源性合成中的作用提供技术依据。

主权项

牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，其特征在于，包括如下步骤：S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据pLVX‑shRNA2‑puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5ul；ddH20 35ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然降温至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于‑20℃备用；S4、用EcoRl、BamHl限制性内切酶双酶切pLVX‑shRNA2‑puro空质粒，37℃，4h，酶切体系如下：pLVX‑shRNA2‑puro空质粒20ul；EcoRl限制性内切酶1ul；BamHl限制性内切酶1ul；10X CutSmart缓冲液5ul；ddH20 23ul；S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX‑shRNA2‑puro空质粒用T4 DNA连接酶连接，16℃，过夜；S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞；将MAC‑T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染，按照lipofectamine^TM2000说明操作，转染48h后检测荧光；S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，‑80℃备用，筛选出最有效的shRNA重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days后提取RNA和总蛋白，‑80℃备用；S8、在NBCI上找到牛的内参基因β‑actin和PSMA5的CDS区序列，用primer premier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：β‑actin‑F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；β‑actin‑R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；PSMA5‑F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’；PSMA5‑R：5’CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3’；反应体系如下：2X FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10ul；引物(上)0.4ul；引物(下)0.4ul；模板cDNA 1ul；ddH20 8.2ul；S9、按照如下程序进行实时荧光定量PCR：条件如下首先在95℃运行2min，之后40个PCR循环(95℃10s；60℃34s)；之后95℃1min；55℃30s；95℃30s；S10、采用2^‑ΔΔct法计算荧光定量结果，在4条设计的shRNA序列中选取干扰效率最高的一条，再转染细胞，进行后续的Western blotting检测。