[发明专利]一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法有效
| 申请号： | 201510802312.9 | 申请日： | 2015-11-19 |
| 公开（公告）号： | CN105349569B | 公开（公告）日： | 2020-05-12 |
| 发明（设计）人： | 易犁;周瑜;张桂敏;彭文舫;马立新;马延和 | 申请（专利权）人： | 湖北大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/66;C12Q1/6897;C12Q1/37;C12Q1/02;C12R1/865 |
| 代理公司： | 武汉帅丞知识产权代理有限公司 42220 | 代理人： | 朱必武 |
| 地址： | 430062 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法。本发明通过在pESD载体上插入不同转录强度的启动子GALX，构建了GALX–pESD‑GAL1/GAL10‑Aga2‑FLAG‑HA重组质粒，在相应的启动子后插入底物序列与酶突变体库，利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白，根据细胞表面荧光的强弱，从而分析底物与酶的不同比例下底物的酶切情况。这种方法在蛋白酶进化过程中，可以控制酶与底物的浓度在1:2到1:100之间，利用启动子转录的强弱来逐步提高酶活，最终获得高活性的蛋白酶突变体。 | ||
| 搜索关键词： | 一组 不同 启动子 蛋白酶 通量 筛选 载体 方法 | ||
【主权项】：
一组用于蛋白酶高通量筛选的空白重组载体，其特征在于，该空白重组载体为pBDYD‑GALX，其结构为GALX‑pESD‑HA‑FLAG‑Aga2‑GAL1/GAL10‑Aga2‑FLAG‑HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和HA为抗体标签；根据启动子GALX的不同，该重组载体通能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化。
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