[发明专利]一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法

摘要

本发明公开一种可同时检测果汁饮料中污染菌的基因快速筛查方法。该方法包括果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现检测样品中是否含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

主权项

1.一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480 μ L 再加入10mg/mL溶菌酶120 μ L ，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；步骤(2)、多重PCR扩增：将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增， 得到扩增产物；所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ L ， 由100nM正向混合引物2 μ L ，100nM反向混合引物2 μ L ，25mM的MgCl2 4 μ L ，5×PCR Buffer 4 μ L ，5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μ L ，DNA模板1 μ L ，余量的双蒸水组成；其中引物体系为步骤(1)得到的SEQ ID NO.1～8引物体系；步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；步骤(4)、检测鉴定：步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉(Penicillium citrinum)；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉(Aspergillus niger)。