[发明专利]一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法

摘要

本发明公开了一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，包括以下步骤：步骤一、PCR扩增海洋球石藻病毒EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶；步骤二、重组质粒pMD19‑T‑SPT的制备：PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T‑A克隆，所用载体为pMD19‑T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；步骤三、重组子pEhux‑SPT的制备：重组质粒pMD19‑T‑SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux‑I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux‑SPT；步骤四、pEhux‑SPT转化球石藻细胞：采用电击转化法将重组质粒pEhux‑SPT与质粒pEhux‑II共转化球石藻BOF92细胞。本发明构建的基因工程海洋球石藻株，通过病毒SPT基因的过表达从而有效提高了藻细胞中神经酰胺的含量。

主权项

1.一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、PCR扩增EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶：采用CTAB法提取海洋球石藻病毒EhV99B1基因组，PCR扩增所用引物为：SEQ ID NO.1：SPT‑F:5’‑AAGCTTATGTACACGGCCGTATTCA‑3’；SEQ ID NO.2：SPT‑R：5’‑AAGCTTCTATGACAGATACTCAATCATAA‑3’；步骤二、重组质粒pMD19‑T‑SPT的制备：PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T‑A克隆，所用载体为pMD19‑T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；步骤三、重组子pEhux‑SPT的制备：重组质粒pMD19‑T‑SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux‑I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux‑SPT，其中，pEhux‑I质粒图谱为：步骤四、pEhux‑SPT转化球石藻细胞：采用电击转化法将重组质粒pEhux‑SPT与质粒pEhux‑II共转化球石藻细胞，于含1.5％琼脂的F/50固体培养基中添加终浓度为50ug/ml的草铵膦作为固体选择性培养基进行转化子的筛选，然后转入不含琼脂的液体选择性培养基中培养8‑12天，收集藻细胞，经PCR验证获得含有病毒SPT基因的球石藻基因工程藻株。