[发明专利]检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒

摘要

本申请公开了一种检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。

主权项

一种检测PD致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：1)加200μl Buffer BL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；3)12000rpm离心1分钟；4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μl HB solution，室温放置5分钟；6)12000rpm离心2分钟；7)加入700μl wash Buffer，12000rpm离心2分钟；8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μl wash Buffer，12000rpm离心2分钟；9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl 70℃预热的洗脱液,室温放置1‑2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；PCR扩增PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μl；HotStarTaq DNA Polymerase按kit标准调整；dNTP mix 2μl；上游引物PrimerU 1μl；下游引物Primer L 1μl；DNA模板xμl；灭菌蒸馏水25μl‑‑‑上述总体积；PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；PCR产物纯化每管内加入100μlPCR‑A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，加入700μl washing buffer，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，加入400μl washing buffer，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，12000rpm离心2min；柱内加入30μl 70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；测序反应反应体系：0.8μl BigDye+1.5μl BigDye Seq Buffer+3μl引物+1μl PCR纯化产物+3.5μl ddH₂O；测序PCR热循环条件：1)变性的条件，96℃10sec；2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；3)延伸的条件，60℃4min；4)4℃保温；每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；测序产物纯化10μl反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；1)每管加入100μl 100％酒精，或每管加入1μl 125mM EDTA到管底，或每管加入1μl 3M NaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；3)每管加入100μl 70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；4)室温挥发净酒精，加入10μl Hi‑Di Formamide溶解DNA；5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；PCR检测，包括：1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；所述引物GBA‑F的核苷酸序列为：5'‑AATTGGGTGCGTAACTTTGTC‑3'，所述引物GBA‑R的核苷酸序列为：5'‑ACTTCCCAGACCTCACCATTG‑3'，所述LRRK2‑F1引物的核苷酸序列为：5'‑TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG‑3'，所述LRRK2‑R1引物的核苷酸序列：5'‑AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC‑3'；所述LRRK2‑F2引物的核苷酸序列为：5'‑AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG‑3'，所述LRRK2‑R2引物的核苷酸序列：5'‑TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG‑3'所述引物PCR扩增出目的片段模板；所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万‑10万倍，终浓度为10‑20ng/μL，作为检测阴性对照用；2)25μL反应体系检测：混合均匀；所有样本混合完后，将ABI Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检测；结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。