[发明专利]一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种利用双重荧光PCR检测A型H5N6亚型禽流感病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增H5和N6基因的PCR引物及探针，其核苷酸序列如Seq ID No：1-6所示，探针5’端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光猝灭基团；RT-PCR反应液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品。本发明还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系、通过荧光定量PCR进行扩增、结果判读等步骤.结果显示，本发明提供的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度高，特异性好等优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测手段。

主权项

一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，主要由以下组分组成：(1)RT‑PCR反应液：含有50mM MgSO₄、0.4mM dNTPs；(2)引物和探针混合液：含扩增H5基因的引物对1、N6基因的特异性引物对2及分别对应的特异性探针；所述引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5‑F为Seq ID No.1所示序列，下游引物H5‑R为Seq ID No.2所示序列：Seq ID No.1：5‑ATTGCTCCAGAATATGCATA‑3；Seq ID No.2：5‑AGARTTTATCGCCCCTATTG‑3；所述引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6‑F为Seq ID No.3所示序列，下游引物N6‑R为Seq ID No.4所示序列：Seq ID No.3：5‑GGGTCGARTGCAYAGGATG‑3；Seq ID No.4：5‑TACCACACYACTRCCGATG‑3；所述H5基因对应的探针H5‑probe为Seq ID No.5所示的序列：Seq ID No.5：5‑CAAAATWGTCAAGAAAGGGG‑3；所述N6基因对应的探针N6‑probe为Seq ID No.6所示的序列：Seq ID No.6：5‑AAGCACGYCATGCCAYGATG‑3；(3)酶混合液：逆转录酶、Taq酶；(4)含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品。