[发明专利]一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法

摘要

本发明涉及一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法，该方法通过选择多态性高的SSR引物，对55份扁桃属植物种质材料进行SSR－PCR扩增反应、电泳检测、统计分析。结果表明：使用筛选自核果类的100对SSR引物中的10对多态性强的引物，对扁桃属植物种质材料的基因组DNA进行SSR-PCR扩增，共扩增出63条扩增条带，其中多态带60条，多态率为95.2%，获得了较好的扩增结果。通过进行相似系数和聚类分析，遗传相似系数为0.4133－0.9600，平均相似系数为0.6867；55份扁桃类植物种质间的遗传差异表明：不同种以及不同品种间的遗传距离不同，在相似系数小于0.68时，大多数栽培品种聚为一类，同一种源区的大多数栽培品种能聚类在一起。为进一步区分扁桃类植物种质资源亲缘关系远近提供了重要途径。

主权项

一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法，其特征在于按下列步骤进行：准备扁桃属植物种质材料：a、早春季，选取健壮、无病虫害的扁桃属植物55份样本的新鲜嫩叶，每份样本以液氮冷冻后放入温度－70℃超低温冰箱中保存备用；扁桃属植物种质DNA的提取：b、迅速加入1000μL，温度65℃预热的含2%十六烷基三甲基溴化铵，1.4M氯化钠，20mM四乙酸二氨基乙烯，100 mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0的缓冲液和8%巯基乙醇的缓冲液，轻轻摇匀；置于温度65℃水浴锅中温浴60 min，其间每隔10 min 轻轻上下晃动摇匀1次，使溶液充分裂解；采用台式离心机离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，吸取上清液，将上清液平均分配转入另外两个新的1500μL离心管中，其中每个离心管中均含有480μL上清液；将每个含有上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1，轻轻上下晃动摇匀，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，吸取上清液，将每个离心管中的上清液合并，转入另一个新的1500μL离心管中，离心管中含有600μL上清液；将装有600μL上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1，轻轻上下晃动摇匀，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，再吸取上清液，将上清液转入另一个新的1500μL离心管中，离心管中含有400μL上清液；将装有400μL上清液的离心管中加入2倍体积的冷冻无水乙醇，放入温度‑20℃冷冻冰箱，时间30min，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15min后有清晰乳白色的DNA白絮沉淀，去除上部液体；再将乳白色的DNA白絮沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤2‑3 次，自然风干后，溶于50μL 含有10 mM三羟甲基氨基甲烷，1mM四乙酸二氨基乙烯，pH8.0的缓冲溶液中，温度‑20℃冰箱保存；c、用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将步骤b得到的DNA浓度稀释至50ng/μl后，置于温度－20℃冰箱中备用；d、SSR引物筛选：根据NCBI数据库上搜索，从来源于核果类果树作物的100对SSR引物中通过初筛和复筛，最终选出10对产物主带明显并且多态性较好的引物进行SSR微卫星分子标记分析，其中SSR 10对标记为：标记1 BPPCT002，其上游引物5^’TCGACAGCTTGATCTTGACC，下游引物5^’CAATGCCTACGGAGATAAAAGAC；标记2 BPPCT004，其上游引物5^’ CTG AGT GATCCATTTGCAGG，下游引物5^’AGGGCATCTAGACCTCATTGTT；标记3 BPPCT032，其上游引物5^’TTAAGCCACAACATCCATGAT，下游引物5^’AATGGTCTAAGGAGCACACG；标记4 BPPCT036，其上游引物5^’AAGCAAAGTCCATAAAAACGC，下游引物5^’GGACGAAGACGCTCCATT；标记5 BPPCT040，其上游引物5^’ATGAGGACGTGTCTGAATGG，下游引物5^’AGCCAA ACCCCTCTTATACG；标记6 Pchgms1，其上游引物5^’GGGTAAATATGCCCATTGTGCAATC，下游引物5^’GGATCATTGAACTACGTCAATCCTC；标记7 Pchgms3，其上游引物5^’ACGGTATGTCCGTACACTCTCCATG，下游引物5^’CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC；标记8 Pchgms10，其上游引物5^’CGTCACGCATCCTTTCATTT，下游引物5^’GACACCTCCATTTGTATCAAAGC；标记9 Pchgms11，其上游引物5^’TTGAGGCCCACTTATTAGCC，下游引物5^’CCCCCATTATTCAAACTTCTG；标记10Pchgms21，其上游引物5^’ACCACCATTTTGGCTCTCTG，下游引物5^’CATGCAACCCAAAACCATCT；e、SSR一PCR扩增反应、电泳检测：SSR‑PCR反应体系20μl反应体系包含：10 ×Taq 酶配套缓冲液，1.5 mmol/L MgCl₂ , 0.25mmol/L dNTPS，SSR上下游引物各为0.2mol/μl，0.5U Taq DNA 聚合酶，DNA 模板30ng， 相应的扩增程序为：温度94℃预变性，4 min，然后是温度94 ℃变性60s，温度55℃复性40 s，温度72 ℃延伸60s，共34个循环后，温度72 ℃延伸8 min 补齐，扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer2.0μl，取2.5μl上样，用8%非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，银染显色；f、统计分析：基于不加权配对组算术方法的聚类分析用NTSYS‑pc 2.10e软件进行数据分析，选择清晰可辨的电泳带，样品有带则记为1，无带则记为0，构建二态数据矩阵；对原始矩阵用SimQual程序求S_SM相似系数及遗传距离矩阵，并用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，基于Wagner简约法的聚类分析用PHYLIP3.65软件包中SEQBOOT、MIX、CONSENSE等程序作出一致性树图，并用TreeView1.6程序生成简约图，构建分子进化系统树。