[发明专利]一种鸭黄病毒核酸液相芯片的检测方法

摘要

本发明公开了一种鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法，包括下列步骤：（1）设计引物探针（2）RT‑PCR反应体系的建立（3）液相芯片检测体系的建立。本发明的检测方法具有高通量、检测灵敏度高、重复性好等优点，结合RT‑PCR技术，通过稳定性试验、特异性试验与灵敏度试验，成功构建了液相芯片技术检测鸭病毒的检测平台。

主权项

1.鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）设计引物探针；（2）RT‑PCR反应体系的建立；（3）液相芯片检测体系的建立；设计的引物探针序列如下：Primer1：DYF:5’‑AGAATCCAGATGCCCAACCA‑3’；Primer2 ：DYR:5’‑Biotin‑CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC‑3’；Probe：DYProbe:5’‑NH2(CH2)12‑TCATAATCCCAAGGCAAC‑3’；RC‑Probe：DY‑RCProbe:5’‑Biotin‑GTTGCCTTGGGATTATGA‑3’；所述的RT‑PCR反应体系的建立包括下列步骤：采用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；在0.2 mL PCR反应管中，依次加入10×RT‑PCR buffer， 2.5μL；各2.5 mmol/L 的dNTP ，2.0μL；10 pmol/μL 引物对， 各1μL；Inhibiter 0.5μL；AMV XL 0.5μL；5 U/μL的AMV TaqμL，0.25μL；25 mmol/L MgCl2， 5.0μL；RNA 模板5.0μL；加入双蒸水7.25μL；使反应体积达到25μL；在PCR仪上进行RT‑PCR扩增，优化并确定RT‑PCR工作程序：50℃ 30min；94℃ 2min；然后94℃ 30sec、58℃ 30sec、72℃ 30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温；扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物；所述的液相芯片检测体系的建立，包括下列步骤：（1）寡核苷酸探针与微球共价偶联①将微球漩涡混合20s充分分散；取75μL 的3×106个微球，于1.5ml离心管中10000g离心1min，去上清；②加入50μL pH4.5的 0.1mol/L甲基咪唑溶液，漩涡混合，超声波处理0.5‑1min；③加入氨基化探针1.0nmol，漩涡混合；④加入2.5μL碳二亚胺溶液充分混匀，室温避光孵育30min；碳二亚胺溶液的配置方法是10mg的碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水；重复④一次；加入1.0ml 0.02% Tween‑20，混匀，10000g离心1min，弃上清；加入1.0ml 0.1% SDS，混匀，10000g离心1min，弃上清；用pH4.5的0.1mol/L甲基咪唑溶液100μL 重悬微球，2‑8℃避光保存，待用；（2）杂交杂交体系包括1.5μL探针偶联微球，33μL 1.5×TMAC 杂交液，14.5μL TE，2.5μL RT‑PCR产物；混合均匀后于98℃变性10min，孵育15min，18000g离心2min 去上清；加入50 μL用1×TMAC 杂交液稀释500倍的并经过PE标记的链亲合素，52下℃孵育10‑15min，18000g离心2min 去上清；加入50 μL 1×TMAC 杂交液，漩涡混合使微球重悬，上机分析。