[发明专利]一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术

摘要

本发明公开了一种简便高效的基因定点编辑方法，涉及到转基因动物的制备、基因功能研究及生物医学领域。睾丸注射法是利用精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力而发展的一种精子介导基因转移方法。本发明方法是优化了动物睾丸注射法，将利用成簇规律间隔短回文重复序列系统（CRISPR/Cas9）构建的载体通过睾丸多点注射或曲细精管显微注射，使之与精子染色体进行整合，实现基因的删除、替换、插入等目的。然后通过自然交配、人工授精等多种途径获得转基因动物后代。该方法充分利用了CRISPR/Cas9基因编辑系统的优势，结合现有的转基因动物技术，在大幅度提高基因修饰动物的获得效率的同时，避开了体外细胞操作的繁琐和对昂贵精密仪器设备的要求。

主权项

一种基于小鼠睾丸内注射的基因定点编辑技术，其特征包括如下步骤：一、睾丸注射液的制备1、载体的构建与检测 根据目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，根据设计出的sgRNA序列合成一对序列互补的双链寡核苷酸序列；将双链寡核苷酸序列与线性化的CRISPR/Cas9质粒连接，转化提取带有特异性靶向目的基因的sgRNA的表达载体（根据需要，载体可以加入合适的表达标签）；2、睾丸注射液（1）注射转染A液：无菌、无血清的DMEM培养液与脂质体Lipofectamine™ 2000按照9：1的比例进行混合；（2）注射转染B液：无菌、无血清的DMEM培养液与CRISPR/Cas9表达质粒混合，每ml DMEM培养液中加入45µg表达质粒；（3）注射转染C液：1%台盼蓝溶液；（4）将等体积的注射转染A液和B液混合，室温下作用30分钟后，继续加入注射转染C液，体积为注射转染A液的1/10，即获得睾丸注射液；二、动物的选择和管理成年雄性动物，睾丸发育正常；在睾丸注射前保定动物，全身麻醉；三、睾丸内注射用手术刀于阴囊开一小口，将单侧睾丸通过开口裸露于体外，用微量注射器吸取相应剂量的试剂，穿过睾丸白膜刺入睾丸实质5‑6mm，将睾丸注射液缓缓注射入睾丸；可睾丸内多点注射，也可进行曲细精管显微注射；对另一侧睾丸进行相同操作；第一次注射后，隔24小时再重复操作一次；四、注射效果的检测与动物的应用第二次注射5天后，采集小鼠精液，提取精子DNA，设计引物，进行PCR和Southern Blotting实验，检测注射效果和外源基因编辑效果；阳性小鼠通过自然交配、人工授精、胞浆内注射等多种途径使外源目的基因进入胚胎，大量、高效的获得转基因小鼠。