[发明专利]一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法

摘要

本发明涉及一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，属于转基因技术领域；该方法首先基于已知基因序列设计特异性引物，克隆AFP1和AFP2目的基因，其全长分别为279bp和276bp，编码92和91个氨基酸，均含有41个氨基酸的小分子信号肽，通过构建包含有AFP1和AFP2的植物表达载体pISV2678并转化剑麻H.11648愈伤组织，获得含有AFP1和AFP2的转基因剑麻植株；与非转基因剑麻相比，本发明转AFP1和AFP2基因剑麻在接种烟草疫霉菌后病斑明显变小，抗性明显增强，参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶PPO的活性明显比非转基因植株高。本发明为提高剑麻斑马纹病的抗性提供了一条新的有效途径。

主权项

一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：包括如下步骤：   （1）橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆以牵牛花成熟种子为材料，采用改良Trizol法提取总RNA，经Ferments公司反转录试剂盒合成第一链cDNA后，采用RT‑PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全长分别为279bp和276bp，编码92个氨基酸和91个氨基酸，AFP1和AFP2同源性高达95%以上，均含有41个氨基酸的小分子信号肽；   （2）植物表达载体构建设计带酶切位点的引物，以第一链cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因AFP1和AFP2，通过定向酶切与载体pISV2678连接，并电击转化农杆菌EHA105，构建含有目的基因AFP1和AFP2的植物表达载体；   （3）农杆菌介导法转化剑麻以剑麻H.11648愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法浸染愈伤组织，然后将浸染后的愈伤组织接种在含有卡那霉素kan⁺和除草剂Basta的不定芽诱导培养基上诱导不定芽，待不定芽长到4‑6厘米高时，转入生根培养基上进行生根，待再生植株长出4‑5条壮根时，移植到基质为椰糠和河沙的塑料遮光大棚中继续培育；愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基+0.1‑1.0mg/L萘乙酸NAA+1.0‑3.5mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤6‑BA，不定芽诱导培养基为：SH基本培养基+1.0‑5.0 mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤6‑BA+0‑1.5 mg/L 萘乙酸NAA+0‑1.5 mg/L 吲哚3丁酸IBA+ 200mg/L卡那霉素kan⁺+ 250 µg/L除草剂Basta，生根培养基为添加200 mg/L羧苄霉素的MS基本培养基；   （4）剑麻转化植株的鉴定取1克转基因植株叶片提取基因组DNA，以DNA为模板，以AFP‑F和AFP‑R为引物，以非转基因植株为阴性对照，经PCR检测后发现基因AFP1和AFP2已经成功转入剑麻；引物AFP‑F：5’‑CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC‑3’；引物AFP‑R：5’‑CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG‑3’；   （5）剑麻转化植株抗病性检测采用叶面针刺法活体和离体接种烟草疫霉菌，48小时候后观察病斑扩展情况，发现转基因植株叶片病斑明显比非转基因植株小；（6）剑麻转基因植株重要防御酶活性测定采用叶面针刺法活体接种烟草疫霉菌，在接种0小时、24小时、48小时和72小时分别测定转基因和非转基因植株超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT和多酚氧化酶PPO的活性，发现转基因植株参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶PPO的活性明显比非转基因植株高。