[发明专利]一种提取衣藻中脂蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种从衣藻的油脂中提取脂蛋白的方法。首先破碎营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞，活性剂清洗除去匀浆中的细胞器，然后盐洗析出杂蛋白，之后尿素清洗使剩余的溶解性蛋白变性沉淀，再用正己烷清洗防止蛋白质被氧化，蔗糖梯度离心后进行蛋白电泳，电泳结束后将目标条带切下进行电泳洗脱得到脂蛋白。本发明克服常规有机溶剂萃取方法中的不足，通过蛋白物理性质和化学性质对杂蛋白进行去除，采用蔗糖梯度离心法不断洗脱杂蛋白最终得到油脂中的脂蛋白，保护油脂中的脂蛋白不受影响，为脂蛋白的相关研究及油脂代谢研究提供基础，在微藻油脂代谢研究中具有潜在的应用价值。

主权项

一种提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，破碎处理，首先将营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞溶液离心收集沉淀，然后加入包含蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物的Hepes‑KOH缓冲液重悬细胞沉淀，之后将细胞破碎，匀浆中加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤2，活性剂清洗，用包含0.1％～0.2％的吐温‑20和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤1收集的油脂，再加入Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤3，盐洗，用包含1M～3M NaCl和0.4～0.6M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤2收集的油脂，再加入包含2M～3M NaCl和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤4，尿素清洗，用8M～10M尿素重悬步骤3收集的油脂，轻微摇晃让余下的蛋白充分变性，再加入Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤5，正己烷清洗，将步骤4收集的油脂层与包含质量浓度为0.003％～0.005％的2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚的正己烷混合，震荡后经高速冷冻离心后收集包含油脂的正己烷相，用高纯氮气吹干正己烷；步骤6，蔗糖梯度离心，用包含0.4～0.6M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤5吹干的油脂，再加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤7，蛋白电泳，将步骤6收集的油脂进行蛋白电泳；步骤8，电泳洗脱，电泳结束后将目标条带切下并清洗干净，然后进行电泳洗脱即得到目的蛋白液。