[发明专利]三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法

摘要

本发明的三孢布拉氏霉菌的样品前处理方法如下：利用PDA培养基培养三孢布拉氏霉菌，培养4d后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用；冷冻研磨破碎菌丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活；真空冷冻干燥后，经过肟化或腙化、硅烷化两步衍生化反应后用于GC-MS检测。本发明还提供了利用GC-MS对上述样品的检测方法，检测条件如下：选用AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样量1μL；程序升温；离子源温度250℃，全扫描范围m/z50～800。采用本发明能得到重现性较好的代谢组检测结果。

主权项

一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：（1）培养三孢布拉氏霉菌：a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48‑52h；种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β‑胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH₂PO₄ 0.25%、MgSO₄∙7H₂O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；（2）样品制备：分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：‑40℃预冷的60%v/v乙醇水、2:2:1v/v的氯仿：乙醇：水、60%v/v沸乙醇、60%v/v冷甲醇；B:样品衍生化取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ‑氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；加80μLN‑甲基‑N‑(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80 min；将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。