[发明专利]应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验的方法

摘要

本发明涉及一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，首先进行斑马鱼胚胎样本前处理，然后在胚胎中加入裂解缓冲液，用广口枪头在冰浴中裂解胚胎，立即进行转座反应并纯化DNA，然后通过实时荧光定量的方法确定建库用的循环数，直接通过一步PCR的方法进行建库测序。ATAC-seq和DNase-seq两种方法都能够对基因组染色质上调控序列进行定位和解读，但ATAC-seq步骤更为简单，需要的细胞也更少，在无法获得大量细胞的情况下，ATAC-seq更有帮助，且根据实验结果ATAC-seq获得的数据富集程度更高。本发明还将其应用到斑马鱼胚胎细胞中，对于研究生物体早期发育过程中的染色质结构的变化及相应的基因表达调控研究提供一种有效且简单的方法。

主权项

一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC‑seq)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)斑马鱼胚胎样本的准备：取斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；(2)斑马鱼胚胎细胞核获取：加入预冷的裂解缓冲液200ul，用200ul广口的移液器枪头冰上反复吹打，直至胚胎完全裂解，离心收集细胞核；(3)转座反应和纯化：立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37度水浴反应30min；转座结束后用Qiagen MinElute Kit进行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA可于‑20度保存；(4)PCR扩增：步骤(3)所得纯化DNA转入0.1mlPCR管中，加入上下游PCR引物，SYBR GreenI，PCR Master Mix，PCR仪器中反应4个循环；上述反应液取出5ul，依次再加入上述引物等，在实时荧光定量PCR仪中反应19个循环，剩下的45ul反应液于冰上放置备用；(5)文库构建及纯化：根据实时荧光定量PCR结果来确定文库构建所有反应的循环数；实时荧光定量曲线图线性化设置(Rn/Cycle)，RF阈值设为5000，循环数的计算为1/4最大荧光值所对应的循环数为该样本建库所需要的循环数；根据计算结果将步骤(4)剩下的45ul样品放入PCR仪中反应，所得文库用AMPure beads纯化后，通过bioanalyzer进行文库质量检测，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。