[发明专利]利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法

摘要

本发明公开了一种重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；本发明还公开了重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白及代谢途径构建中的应用。以及利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，以判定待测外源基因是否成功表达。该方法比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，同时，筛选过程中获得的可表达外源基因的转化子可通过复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要；通过该方法还可以建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，该系统可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。

主权项

1.利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子Ⅰ；步骤二、将所述转化子Ⅰ培养产孢，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和阴性对照组获得分析图Ⅰ和分析图Ⅱ，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及步骤四、重复步骤二，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；其中，所述转化子孢子Ⅰ为实验组，所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢子，所述丝状真菌的转化子Ⅱ为待检测组。