[发明专利]一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法。本发明通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、RACE克隆技术，合成出了干旱胁迫反应基因AhAP2ER。本发明还通过使用荧光定量RT-PCR对AhAP2ER基因干旱胁迫下的表达进行分析，并最终得出AhAP2ER基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照组具有明显的抗旱特性，说明AhAP2ER基因能显著提高花生抗旱性。

主权项

一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)材料的准备与处理材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为26‑28℃，生长14天用于后续的干旱胁迫处理；干旱胁迫用PEG6000处理，花生根浸泡在20％PEG6000溶液中，在处理0h、6h、12h、18h、24h、48h和72h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于‑80℃超低温冰箱中备用；(b)RNA的提取和cDNA的合成用TAKARA的MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒方法分离提取花生幼苗RNA，将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA合成，用SMART‑RACE试剂盒方法进行cDNA合成，之后将反转录产物于‑20℃低温冰箱中保存备用；(c)通过RACE进行克隆RACE所用试剂盒为Clontech的SMART‑RACE试剂盒，RACE扩增基因全长所用引物为GPS‑AhAP2ERf‑1:5’CGTTTACCCGTTGACTCCATTC‑3’、GPS‑AhAP2ERr‑1:5’‑TACCGACGCAAAGACGCAAGGTA‑3’和NGPS‑AhAP2ERr‑1：5’‑GTATAATCAGTCACTGGGAAG‑3’；RACE克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用UNIQ‑10PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM‑T Easy载体后转化至感受态E.coli TOP 10，于LB培养基培养，随机挑取扩大培养，再进行PCR扩增检测并测序；将测序的结果进行拼接后设计全长PCR扩增产物，用UNIQ‑10PCR Purification Kit试剂盒纯化，纯化产物与pGEM‑T Easy载体连接后转化至感受态E.coli TOP 10中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序，扩增引物为AhAP2ER‑S1：5’‑AAACGCTCGCACACTG‑3’和AhAP2ER‑S2：5’‑CATTTGTATTACCATGAGAATGC‑3’。