[发明专利]一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法

摘要

一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，涉及如下步骤：重组表达需比较比活性的起始酶及其突变体；超声、化学裂解或冻融裂解宿主细胞，离心上清液用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；用纯化后起始酶或某个突变体为免疫原，免疫哺乳动物所得抗血清为多抗；用聚乙二醇促进免疫复合物形成，测定样品和多抗反应混合物在310到410nm间某波长下光密度与630到800nm间某波长下光密度之差为检测信号，用前述免疫原为参考品建立选择性测定样品中起始酶及其突变体蛋白量的免疫比浊法；用此免疫比浊法均相测定样品中起始酶或其突变体的蛋白量，据样品中酶活性换算成比活性用于排序或计算相对值进行比较。此方法效率高且不依赖于融合标签表达酶及其突变体。

主权项

1.一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其特征在于：(一)拟定量比较比活性的酶及其突变体合称目标酶；其中，所述酶为起始酶，其余突变体来自该起始酶的定点突变、随机单位点突变或随机多位点突变，且目标酶在原核或真核宿主细胞中能直接可溶性活性表达，或与增溶标签后融合后在原核宿主细胞中能可溶活性表达；(二)通过如下的步骤，均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性：(1)制备针对目标酶的多抗：选需要定量比较比活性的起始酶或某个突变体，重组表达后纯化到70％以上纯度作为免疫原；选体重在0.2kg以上哺乳动物，哺乳动物选自兔子、豚鼠和羊，用所选免疫原对该哺乳动物进行多次免疫；首次免疫用弗氏完全佐剂，此后用弗氏不完全佐剂，相邻两次免疫的间隔长于1周但短于4周，合计免疫3次以上；免疫次数达到要求后，收集被免疫哺乳动物的血清作为抗血清，用0.22μm滤膜过滤的滤液为所需多抗；(2)重组表达目标酶：以可溶性活性表达为前提选择重组表达所需宿主细胞和表达载体；难以在原核宿主细胞中直接可溶活性表达的真核酶蛋白，用增溶标签在原核宿主细胞内进行融合表达；所有目标酶用相同宿主细胞和表达载体进行重组表达，优化条件使表达效率满足如下要求：(a)如宿主细胞中没有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的百分含量即丰度不低于1％；(b)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性可溶性内源性酶的20倍；(c)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的部分可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性内源性酶可溶部分的20倍；(3)制备未纯化目标酶的样品：目标酶诱导表达后收集宿主细胞用超声处理、化学裂解或冻融裂解，将裂解液离心得上清液，再用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；(4)建立免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量：以免疫原或其它某个目标酶为参考品；在总体积为0.050到3.0ml的中性的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液中，将多抗与参考品混匀且参考品在反应体系最终浓度在1.0～30.0mg/L，并在混合后的反应体系加入分子量2,000到1,0000道尔顿的聚乙二醇达到30g/L以上；室温反应5.0到30min后测定310到410nm间某个波长的消光值及630到800nm间某个波长下的消光值，以前者消光值减去后者消光值为响应信号即纵坐标，以反应体系所含参考品最终浓度为横坐标作图得参考品的响应曲线；用参考品终浓度的一次或二次多项式拟合响应曲线，对应最好拟合函数为响应函数；以响应信号达到拟合响应曲线所得回归估计标准差三倍对应参考品最终浓度或响应信号为检测下限，与用响应函数预测的响应信号相差不超过回归估计标准差两倍的最大响应信号或其对应参考品最终浓度为定量上限；(5)测定样品中目标酶活性：用目标酶的底物，常规测定未纯化目标酶样品中目标酶活性；用相同的活性单位定义，换算成样品中目标酶活性浓度；(6)测定样品中目标酶蛋白量：用样品代替参考品与前述多抗反应，以免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量；调整加样量，使所得响应信号比检测下限高30％以上而低于定量上限对应的响应信号；用响应函数换算成样品中的目标酶蛋白浓度；(7)计算样品中目标酶比活性：据前述所测样品中目标酶活性浓度除以免疫比浊法选择性测定所得样品中的目标酶蛋白浓度，得到样品中的目标酶比活性；(8)比较未纯化目标酶比活性：对目标酶比活性排序比较，或以起始酶或某个突变体为比较对象，将其余目标酶比活性除以比较对象的比活性得到相对比活性，再进行比较。