[发明专利]一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途。本发明明确了oxLDL能够上调TF表达，其是在LOX-1介导下启动的信号调控，重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明β2-GPIDV干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。除OxLDL与LOX-1的结合诱导TF表达引发血栓以外，二者的结合还可引发内皮细胞功能障碍、导致炎症介质的产生等，对于动脉粥样硬化血栓形成及其发展起到重要作用，因此本发明显示了重组β2-GPIDV在动脉粥样硬化血栓形成疾病方面的潜在治疗作用。

主权项

一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途，其特征在于，步骤为：(一)oxLDL经由LOX‑1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达(1)qRT‑PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX‑1和TF量设计β‑actin、TF、LOX‑1三对引物，三对引物分别为：β‑actin上下游引物如下：上游引物：5′‑ATTGCCGACAGGATGCAGAA‑3′，下游引物：5′‑GCTGATCCACATCTGCTGGAA‑3′；TF上下游引物如下：上游引物：5′‑CCCAAACCCGTCAATCAAGTC‑3′，下游引物：5′‑CCAAGTACGTCTGCTTCACAT‑3′；LOX‑1上下游引物如下：上游引物：5′‑GGTGCTGGGCATGCAATTAT‑3′，下游引物：5′‑CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA‑3′，以β‑actin为内参分析TF、LOX‑1基因水平表达情况，数据显示10μg/mL oxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX‑1和TF的mRNA表达上调，P<0.05；(2)Western‑Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX‑1和TF量10μg/mL oxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX‑1和TF的蛋白表达上调，P<0.05；(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX‑1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量下调与scrambled siRNA相比，LOX‑1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量下调，以上说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX‑1介导下启动的信号调控；(二)beta2‑糖蛋白第五结构域β2‑GPI DV干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX‑1和TF蛋白表达22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2‑GPI DV分别和10μg/mL的oxLDL共同刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX‑1和TF蛋白表达量下调，且重组β2‑GPI DV浓度越大，抑制率越高，表明重组β2‑GPI DV浓度依赖性的抑制oxLDL诱导的TF和LOX‑1的表达；(三)建立表达人LOX‑1基因的293T细胞模型，并检测其表达定位及生物学功能设计一对上下游引物，如下：上游引物：5′‑CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG‑3′下游引物：5′‑TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC‑3′其中，上游引物中5′端含有保护碱基、Nhe I酶切位点(单划线)以及LOX‑1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoR I酶切位点(单划线)、LOX‑1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子；将引物以LOX‑1片段为模板通过PCR扩增获得LOX‑1基因片段，并克隆到表达载体pIRES2‑AcGFP1‑Nuc上，构建表达质粒pIRES2‑LOX‑1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微镜检测质粒转染效率，RT‑PCR和Western Blot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基因表达定位及其功能，结果表明，LOX‑1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜上，具有结合oxLDL的生物学活性；(四)β2‑GPI DV抑制oxLDL诱导的TF和LOX‑1的表达的分子机理利用上述建立的表达LOX‑1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2‑GPI DV对LOX‑1与DiI‑oxLDL结合的抑制作用，结果显示β2‑GPI DV浓度依赖性的干预oxLDL与DiI‑oxLDL的结合。