[发明专利]赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法

摘要

本发明公开了一种赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法。本发明以赤魟软骨为原料，通过胶原蛋白提取、胰蛋白酶和中性蛋白酶双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化胶原肽Gly‑Ile‑Glu‑Gly‑Glu‑Glu‑Gly‑Trp，ESI‑MS测定分子量为875.85 Da；制备的高活性抗氧化胶原肽对DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂进行开发。

主权项

赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）赤魟软骨胶原蛋白的制备：将赤魟软骨晒干、粉碎，按照料液比1 g:15～20 mL加入到NaOH溶液于1～4℃下浸泡2～4 h，脱除非胶原蛋白；处理后赤魟软骨用蒸馏水反复洗涤至中性、沥干，按照料液比1 g: 5～8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液，于1～4℃下浸泡2～3天，蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙赤魟软骨粉；将脱钙赤魟软骨粉按照料液比1 g:5～8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3 d，10 000g离心20～25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0 mol/L，静置60～90 min，12 000g离心25～30 min得沉淀物，冷冻干燥即为赤魟软骨胶原蛋白；2）赤魟软骨胶原蛋白的酶解：将赤魟软骨胶原蛋白按照料液比1 g:15～20 mL加入到磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液，按照胶原蛋白质量的1.0～1.5%向溶液中加入胰蛋白酶，于温度45～50℃酶解3～4 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持8～10 min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.5～1.8%向溶液中加入中性蛋白酶，于温度45～50℃下酶解6～8 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持15～20 min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；3）赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备：将上述酶解产物采用3.5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3.5 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化胶原肽；其中，所述步骤1）中的NaOH溶液为0.1 mol/L；EDTA溶液为0.5 mol/L，且每天更换1次；步骤2）中的磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液为0.2 mol/L 、pH值为7.5；胰蛋白酶为1.9×10⁴ U/g ；中性蛋白酶为1.0×10⁵ U/g 。