[发明专利]一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法

摘要

本发明涉及一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，属于动物分子育种的基因工程技术领域；所述的基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体步骤为：1）总RNA的提取；2）RNA沉淀的清洗；3）RNA的溶解；4）总RNA纯度、浓度及完整性检测；5）总RNA电泳检测；6）PCR引物设计；7）检测LEAP-2基因的表达量来基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化影响和被病原微生物感染，在脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。

主权项

一种基于LEAP‑2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)RNA的提取①选取同一批次出壳的云南地方鸡的健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；加入RNAiso Plus；②将匀浆液转移至离心管中；③向匀浆裂解液中加入RNAiso Plus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；④室温静置5分钟；⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的含RNA上清液、中间的含DNA的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5‑1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；⑦4℃条件下离心10分钟；2)RNA沉淀的清洗弃去上清液，加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，在4℃条件下离心5分钟后小心弃去上清液；3)RNA的溶解打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase‑free水溶解沉淀，最后将RNA溶液贮存于‑80℃；4)总RNA纯度、浓度及完整性检测取1μL总RNA溶于99μL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在OD260nm、OD280nm的吸光值，并求出两者的的比值；5)总RNA电泳检测取3μL总RNA样品经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳结果；6)PCR引物设计根据GenBanK中原鸡(Gallus gallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer 5.0设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR；引物序列为F:5’‑GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC‑3’；R:5’‑TGCATTCACTGTTATCCCTACA‑3’；7)检测LEAP‑2基因的表达量检测云南四个地方鸡种肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中LEAP‑2基因的表达量，荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环。