[发明专利]一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法及其应用，该法基于BiFC系统，构建SUMO1、SUMO2/3的C端或N端连接YFPn的逆转录表达载体，将待检测对象的多个基因的cDNA克隆入含有YFPc的逆转录表达载体；病毒感染后，将同时稳定表达融合蛋白：SUMO-YFPn和待筛选蛋白-YFPc。如果是发生相互作用的蛋白，则可在FITC波长下观察到荧光信号，即筛选出活细胞内SUMO的修饰底物。该法可同时筛选SUMO1/2/3发生共价修饰和非共价修饰的蛋白底物，以及筛选在刺激和非刺激下SUMO共价或非共价修饰底物的结合情况，可筛选SUMO弱结合的蛋白底物，信噪比、灵敏度高，假阳性低。

主权项

一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法，其特征在于，该法基于BiFC系统，以克隆的方式，构建SUMO1、SUMO2/3的C端或N端连接YFPn的逆转录表达载体，将待检测对象的多个基因的cDNA克隆入含有YFPc的逆转录表达载体；病毒感染后，将同时稳定表达以下融合蛋白：SUMO1cvn‑YFPn和待筛选基因‑YFPc、SUMO2/3C‑YFPn和待筛选基因‑YFPc、SUMO1nvn‑YFPn和待筛选基因‑YFPc、SUMO2/3nvn‑YFPn和待筛选基因‑YFPc；如果SUMO底物和SUMO发生相互作用，则可在FITC波长下观察到发荧光信号，即筛选出活细胞内SUMO修饰底物；其中，所述构建SUMO1、SUMO2/3的C端或N端连接YFPn的逆转录表达载体的策略是：当需要同时检测与SUMO发生共价和非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的N端上连接YFPn；当需要检测与SUMO发生非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的C端上连接YFPn。