[发明专利]阿魏酸转化为香草醛的方法

摘要

提出一种将阿魏酸转化为香草醛的拟无枝酸菌属ATCC 39116培养物–突变体F33或突变体F86。

主权项

一种将阿魏酸转化为香草醛的拟无枝酸菌属ATCC 39116培养物–突变体拟无枝酸菌属ATCC 39116Δvdh(F33)，根据以下方法得到，其包括以下步骤：(a1)用NaeI/SacII消化大肠杆菌‐拟无枝酸菌穿梭载体p6apra以删除拟无枝酸菌复制起点的主要部分，从而得到含有用于在大肠杆菌中复制的oriV、安普霉素抗性基因和一些用于克隆的独特限制位点的片段(3575bp)；(a2)重新接合片段并用得到的质粒p6sui转化大肠杆菌；(a3)由pSETGUS分离葡萄糖醛酸苷酶基因作为SpeI/EcoRV片段并克隆至NheI/DraI‐线性化自杀质粒p6sui，得到p6suigusA；(a4)通过同源重组删除vdh基因，其中使用以下低聚核苷酸扩增拟无枝酸菌属ATCC 39116基因组中vdh的上游和下游侧翼区：上游区域：vdhLF_for3(5’‐TCGTACTTCGCGGTGATCTCGTGG‐3’)和vdhLF_rev_RF(5’‐GCGCATCAGGAGTGACACGCGCGGCGGGGGCG‐3’)；下游区域：vdhRF_for_LF(5’‐CGCCCCCGCCGCGCGTGTCACTCCTGATGCGC‐3’)和vdhRF_rev3(5’‐TTGCAGTCCTTTGTAGAGCGACACG‐3’)；(a5)纯化得到的扩增物并在随后的使用引物vdhLF_for3和vdhRF_rev3的融合PCR中结合；(a6)将得到的包括vdh上游和下游区域的片段Δvdh克隆至自杀质粒p6suigusA的EcoRV‐位点；(a7)由大肠杆菌移除得到质粒p6suigusA::Δvdh并将载体转运至拟无枝酸菌属ATCC 39116；以及(a8)根据正确基因型选择拟无枝酸菌属ATCC 39116的转化体并培养得到第二重组子。