[发明专利]一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法

摘要

本发明涉及一种利用滚环扩增‑环介导等温扩增两步扩增法检测MicroRNA的方法。首先设计一个以目标microRNA为环化连接探针的线性滚环扩增模板，并以该线性滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以这些短单链为模板进行环介导扩增，实现信号的第二步放大。环介导等温扩增的扩增过程由实时荧光定量PCR监测，扩增的样品中加入DNA显色剂，当扩增的DNA产物增多时，DNA显色剂的荧光增强，其荧光信号被实时荧光定量PCR采集和输出。本发明采用两步扩增法放大microRNA的信号，是一种低背景高灵敏度的检microRNA的方法。

主权项

1.一种非疾病诊断目的的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计含有限制性内切酶位点的线性滚环扩增模板，以目标microRNA为连接探针将线性滚环扩增模板连接成环，并以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以上述短单链为模板进行环介导扩增，实现信号的第二步放大；具体包括以下步骤：(1)首先针对目标microRNA设计一个5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，所述的线性滚环扩增模板包括三个区段：与目标microRNA一端互补的5’端区段、与目标microRNA其余片段互补的3’端区段及含有一个限制性内切酶位点的中间区段；(2)模板环化过程：向含目标microRNA的体系中加入DNA连接酶和5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，目标microRNA与5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板碱基互补配对使5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板首尾相连，得到成环的滚环扩增模板；(3)滚环扩增过程：向体系中加入dNTP和DNA聚合酶，37℃扩增4‑6h，80℃灭活15min，以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，得到滚环扩增产物；(4)切割过程：用限制性内切酶将滚环扩增产物切割成若干个完全相同的短单链；(5)环介导等温扩增过程：以步骤(4)所述的短单链为模板进行环介导等温扩增，然后向环介导等温扩增产物中加入DNA显色剂，并用实时荧光定量PCR采集和分析扩增信号。