[发明专利]一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法有效
| 申请号： | 201610046663.6 | 申请日： | 2016-01-16 |
| 公开（公告）号： | CN105505806B | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 周晨妍;刘振华;王燕;王拥涛;李同彪;朱新术 | 申请（专利权）人： | 新乡医学院 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 453003 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法，首先利用生物信息学比对木聚糖酶XynZF‑2基因序列与耐热木聚糖酶EvXyn11基因序列的同源性，通过N‑端替换将XynZF‑2的N‑端48个氨基酸替换成木聚糖酶EvXyn11N‑端的34个氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，进而在XynZF‑2酶C端继续引入二硫键Cys38‑Cys191、α‑螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入糖基化修饰位点E42N和F17S，构建多位点突变杂合酶XynZL，期望杂合酶XynZL的热稳定性有所改善。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 糖酶 引入 基因序列 酶工程 杂合酶 菌株 杂合 种木 芳香族氨基酸 耐热木聚糖酶 疏水性氨基酸 氨基酸替换 生物信息学 糖基化修饰 木聚糖酶 热稳定性 点突变 二硫键 同源性 氨基酸 比对 成木 多位 位点 替换 期望 | ||
【主权项】：
1.一种木聚糖酶杂合酶重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：目的基因的合成及重组表达载体的构建合成设计好的杂合酶基因xynZL序列；所述杂合酶基因xynZL序列如SEQ ID NO.1所示，编码193个氨基酸如SEQ ID NO.2所示；参考杂合酶基因xynZL基因序列以及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点，设计合成以下两条引物：YS：5’‑CCGGAATTCTTCCCCACGACTCTGTCG‑3’YX：5’‑ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAACACAGATGGACG‑3’；以xynZL基因为模板，YS、YX为引物进行PCR扩增，扩增产物回收后，与对应表达载体经双酶切、回收、连接，连接液转化E.coli DH5α感受态细胞，转化液分别涂布含Amp的LB平板，阳性克隆子筛选后，提取质粒经酶切及PCR验证，最终获得重组质粒pPIC9K‑xynZL。
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