[发明专利]一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法

摘要

本发明公开了一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，获得细菌突变株；将细菌突变株经发酵培养，取培养液分离纯化，得到降低分子量的多糖；本发明提供了一种通过基因工程手段改造产荚膜多糖细菌，以获得更低分子量的多糖产物，该方法可适用于E.coli，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，实现保持多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。

主权项

1.一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，其特征在于所述方法为敲除E.coli K5的waaR基因，获得E.coli K5突变株；将E.coli K5突变株接种至发酵培养基，在30‑37℃、120‑200rpm培养24‑33小时，发酵结束后将发酵液在8000‑10000rpm离心10‑30min，弃去菌体，得发酵上清液，将发酵上清液用体积浓度1.0‑2.0％的过氧化氢水溶液脱色，4‑25℃过夜后，离心去除沉淀，取上清液用质量浓度50‑70％饱和硫酸铵进行盐析，4‑25℃存放过夜；次日8000‑10000rpm离心10‑30min，沉淀物用200‑3000Da透析袋进行透析脱盐，浓缩并冻干，得到降低分子量的肝素前体；所述发酵培养基组成为：十二水合磷酸氢二钠10‑25g/L，磷酸氢二钾0.2‑2g/L，氯化铵2‑6g/L，葡萄糖10‑30g/L，盐酸硫胺素5‑100mg/L，5‑20mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为水；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁2‑20g/L，氯化钙0.2‑4g/L，七水合硫酸锌0.2‑10g/L，四水合硫酸锰0.1‑2g/L，五水合硫酸铜0.2‑2.0g/L，四水合钼酸铵0‑0.2g/L，十水合四硼酸钠0‑0.2g/L，溶剂为1‑5mol/L HCl水溶液。