[发明专利]晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法

摘要

本发明公开了一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况。本发明借助于ISET技术分离富集CTCs，依靠细胞免疫荧光技术鉴定CTCs，克服了单纯ISET技术鉴定CTCs存在的困难和单纯免疫学检测技术存在的假阴性。该技术设备要求不高，方法易于掌握，并能实时监测。通过该技术方法，不用取材乳腺癌组织即可检测到晚期乳腺癌患者PR表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能实时检测。

主权项

一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于，利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况；所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC，步骤如下：1)采集晚期癌症患者外周血：肘正中静脉5ml；2)将外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA，稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；3)利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；4)过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器(3)，PBS冲洗2‑3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上；所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞，步骤如下：1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；2)PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭30min；3)加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；4)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；5)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；6)PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜(7)置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；7)荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：1)外周血过滤后，从过滤装置中取下滤器(3)，打开并移走滤器上口(6)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜(7)，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；2)制作薄层切片：A、脱色：将上述带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下，置于95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀的脱色液中浸泡4‑6小时，脱去CTC染色液；B、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；C、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4‑6h；D、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；E、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2‑4μm的薄层切片；所述的检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况，步骤如下：1)烤片：CTC蜡块薄层切片在60℃恒温箱中烤片2小时；2)脱蜡：切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟；3)水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟，自来水、蒸馏水冲洗；4)抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，800W加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；5)蒸馏水冲洗；6)去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；7)蒸馏水冲洗；8)PBS浸洗5次各1.5分钟；9)滴加一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；10)滴加二抗；11)37℃水浴锅中孵育20分钟；12)PBS浸洗5次各1.5分钟；13)显微镜下控制，DAB显色；14)自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；15)自来水冲洗5分钟；16)75％‑95％‑100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；17)细胞病理学专家阅片，判读PR表达情况。