[发明专利]农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法

摘要

本发明提供一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，首次采用吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。

主权项

农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株；所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0‑5.2g/L+维生素B5培养基0.8‑1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0‑1.5g/L；其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L；所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES 3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B60.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L；所述共培养培养基中含有终浓度为0.1‑400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸；所述筛选培养基中含有终浓度分别为1‑2mg/L的6‑苄氨基嘌呤和0.01‑0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6‑苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。