[发明专利]一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法

摘要

本发明公开了一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，属于分子生物学领域。本发明通过对DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3全基因组序列进行比对，在序列保守区分别分段设计兼并引物，其中两对扩增部分重叠区的大片段引物，扩增范围除了5’UTR和3’UTR部分序列外，包含大部分基因组序列，以DHAV cDNA为模板用此两对引物进行扩增，并将扩增片段构建到T载体。在这两对引物扩增大片段区域内，在保守区分别设计8个扩增区域部分重叠的小片段测序引物。本发明节省了构建测序克隆的数量，降低了工作量，同时解决了长片段测序要根据已测序列再设计合成测序引物的问题，节省了测序时间。

主权项

一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取鸭甲型肝炎病毒RNA，并通过反转录制备鸭甲型肝炎病毒cDNA；(2)鸭甲型肝炎病毒基因组5’端和3’端的扩增：使用5’RACE试剂盒、引物5gps1out和5gps1in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组5’端；使用3’RACE试剂盒、引物3GPS1‑out和3GPS1‑in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组3’端，将扩增的鸭甲型肝炎病毒基因组5’端和3’端进行胶回收纯化备用；(3)鸭甲型肝炎病毒基因组大片段的扩增：以DHAV cDNA为模板，分别使用引物对DHV3897A‑F、DHV3897A‑R和DHV4867B‑F、DHV4867B‑R进行PCR扩增，将两扩增产物进行胶回收纯化备用；(4)将步骤(2)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司进行测序，测序引物为T载体测序引物；将步骤(3)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司分别以引物对F1‑F和F1‑R、F2‑F和F2‑R、F3‑F和F3‑R、F4‑F和F4‑R、F5‑F和F5‑R、F6‑F和F6‑R、F7‑F和F7‑R、F8‑F、F8‑R作为测序引物进行测序；(5)以已知的鸭甲型肝炎病毒全基因组序列为参考，将各测序片段进行组装；上述各引物序列如下：5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；3GPS1‑out：TGTGTTGGMTATGACATC；3GPS1‑in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；DHV3897A‑F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，DHV3897A‑R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；DHV4867B‑F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，DHV4867B‑R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；F1‑F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA，F1‑R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；F2‑F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG，F2‑R：TCTCCATAGCTRACRACATA；F3‑F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG，F3‑R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；F4‑F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG，F4‑R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；F5‑F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT，F5‑R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；F6‑F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT，F6‑R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；F7‑F：CCCTATGCCATCTTGGATCT，F7‑R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；F8‑F：CCAAACCCCTTAATTCAACG，F8‑R：ATCAACAGTRTTRGAGGTTCC；引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K代表碱基G或T，S代表碱基G或C。