[发明专利]一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法

摘要

本发明提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度近100％的AT‑III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。此外，本发明还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取利用α1‑抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离提取，可有效降低α1‑抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。本发明的方法能显著提高血浆综合利用效率，具有较强的应用价值。

主权项

1.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)沉淀溶解：取Cohn法组份IV沉淀溶解于5‑12倍体积的pH6‑8.5的缓冲液中，搅拌，过滤，得到滤过液；(b)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween‑80/0.3％TNBP进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6‑7.5；(c)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6‑7.5的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3‑6个柱体积后上样，用pH6‑8.5的缓冲液洗柱2‑5个柱体积，用pH6‑8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；(d)亲和层析吸附目的蛋白：将AAT Select亲和柱和肝素亲和柱进行串联连接，用含0.1‑0.5M NaCl的pH6‑8.5的缓冲液平衡层析柱2‑6个柱体积；将步骤(c)的洗脱液上样串联的层析柱，用含有0.1‑0.5M NaCl的pH6‑8.5的缓冲液洗柱2‑5个柱体积，收集串联层析柱的流穿液；将两根串联的层析柱分离；(e)抗凝血酶III产品制备：步骤(d)的中的肝素亲和柱用pH6‑8.5并含有10‑500mmol/L柠檬酸和0.5‑2mol/L NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；用pH6‑8.5并含有10‑500mmol/L柠檬酸和0.5‑2mol/L NaCl的缓冲液平衡疏水层析柱2‑6个柱体积后，上样肝素亲和柱洗脱液，收集上样后的流穿液；将疏水层析柱的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶III制品；(f)α1‑抗胰蛋白酶产品制备：将步骤(d)的AAT Select亲和柱用pH6‑8.5并含有1‑2mol/L MgCl₂的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；用pH6.5‑7.8的缓冲液平衡分子阻排层析柱后，上样AAT Select亲和柱洗脱液，收集α1‑抗胰蛋白酶；浓缩、分装、冻干，对冻干制品进行80℃、72小时干热病毒灭活，得到α1‑抗胰蛋白酶制品；(g)白蛋白制备：步骤(d)中的流穿液经G25脱盐后转换于pH3‑5.5的缓冲液中，然后上样CM阳离子交换层析柱，流穿液继续上样Superdex 200层析柱，收集白蛋白组分，浓缩、巴氏灭活、分装，得到白蛋白制品。