[发明专利]一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基因组DNA的PCR‑free测序文库制备方法，包含下述步骤：(1)基因组DNA超声波打断；(2)对片段DNA进行纯化回收；(3)片段化DNA末端修复；(4)末端修复产物纯化回收；(5)DNA末端加A；(6)末端加A产物纯化回收；(7)DNA两侧加测序接头进行连接反应；(8)对连接产物进行片段筛选，回收产物即为测序文库；(9)对文库进行质检和上机测序。本发明提供了上述步骤(1)基因组DNA超声波打断方法、步骤(2)(4)(6)中对产物进行纯化的方法、步骤(3)(5)(7)中反应体系和条件以及步骤(7)中兼容于Illumina二代测序仪的测序接头的设计和使用方法，保证了本发明所提供的PCR‑free文库构建方法能够快速顺利的进行，利用该方法可得到不经过PCR反应(PCR‑free)而直接制备成上机测序的文库。

主权项

一种基因组DNA的PCR‑free测序文库制备方法，具体包括以下步骤：(1)对基因组DNA进行超声打断；(2)对超声打断的片段进行纯化回收；(3)利用NEB末端修复试剂对纯化产物进行末端修复；(4)对末端修复产物进行纯化回收；(5)利用NEB末端加A试剂对上述纯化产物进行DNA末端加A反应；(6)对上述加A产物进行纯化回收；(7)对上述纯化产物进行连接反应，本发明专利设计了多种兼容于Illumina二代测序仪的测序接头，接头序列含有标签(Index)序列，可同时对多个样品进行标记，接头引物合成采用HPLC，使用前需进行一定条件的处理；接头序列为：P5(5’‑3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T(SEQ ID No.1)P7(5’‑3’):/5’Pho/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID No.2)其中P7引物序列种的六碱基序列NNNNNN代表标签(Index)序列，标签(Index)序列用于标记不同的样品，可以将带不同标签(Index)序列的样品构建混合文库；(8)对连接产物进行片段筛选，回收产物即为测序文库；(9)对文库进行质检和上机测序，检测测序文库的浓度和片段大小，利用Illumina公司的二代测序仪对浓度和片段大小符合要求的文库进行高通量测序。