[发明专利]一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2‑ARE通路激活剂的制备方法。本发明以金枪鱼碎肉为原料，通过双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、活性炭吸附和大孔树脂纯化得金枪鱼高F值寡肽，再利用凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到活性多肽Ile‑Glu‑Leu‑Val‑Trp，ESI‑MS测定分子量为658.76 Da；制备的高活性多肽对羟自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2‑ARE通路，可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、衰老等与Nrf2‑ARE通路密切相关疾病治疗的药物和功能产品。

主权项

一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2‑ARE通路激活剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）金枪鱼碎肉的酶解：取金枪鱼碎肉匀浆，按固液比1 g:10mL～15 mL加入Gly‑NaOH缓冲液，用HCl或NaOH调节pH到9.0～10.0，将溶液温度调制55～65℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.0 %～1.5 %加入碱性蛋白酶，酶解时间3.5 h～4.0 h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至45～55℃，调节pH到6.0～7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.8 %～1.0%加入复合风味蛋白酶，酶解时间2.5 h～3.0 h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于8000～10000 rpm离心15～20 min，取上清液；2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至2.5~3.5，按照物料与活性炭颗粒比为10～15:1将超滤酶解液以0.3～0.5mL/min 流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用2～3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成10～20 mg/mL的溶液，调pH值至6.5～7.5，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为10～15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用2～3倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽；3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2‑ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2‑ARE通路激活剂；其中所述步骤1）中的Gly‑NaOH缓冲液为0.05mol/L，pH值为9.5；碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×10⁵ U/g；复合风味蛋白酶的酶活力≥1×10³ LAPU/g。