[发明专利]一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法

摘要

本发明涉及一种分离纯化细胞的方法，尤其涉及一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，属于医学技术领域。本发明首次通过小鼠肝脏机械循环灌注和免疫磁珠成功分离了肝脏枯否细胞，该方法获得的枯否细胞纯度高、活性好、操作简单、可推广性强，且具有特定的F4/80⁺CD11c^-表型，具有更强的巨噬细胞特征。该细胞分选技术的成功建立，为枯否细胞的进一步功能研究提供了一种新的实验方法。

主权项

一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，包括在无菌条件下，进行以下步骤：第一步、建立肝脏机械灌注系统，在离体的肝脏、门静脉、肝下下腔静脉及行门静脉置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心房行上腔静脉置管并固定，结扎肝下下腔静脉后，分别将门静脉置管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路；第二步、获得细胞，利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝脏灌注消化，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细胞悬液经200目滤网滤过，转至离心管后置于旋转摇荡器，将实验室水浴震荡器设定至37℃、140rpm，震荡10分钟，而后转入离心机中50G离心1分钟后取上清，再将上清以150G离心8分钟弃上清，即得富含肝非实质性细胞悬液；第三步、免疫磁珠分离F4/80⁺CD11b^‑ CD11c^‑枯否细胞，先进行阴选，根据细胞计数结果，加入5ul/10⁷的CD11b FITC，CD11c PE抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti‑PE Microbeads和Anti‑FITC Microbeads，4℃孵育15分钟，LS分选柱行阴选，收集过磁柱后的细胞悬液；再进行阳选，根据阴选后细胞悬液细胞数量，加入5ul/10⁷的F4/80APC抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，加入Anti‑APC Microbeads，4℃孵育15分钟，MS分选柱行阳选，收集磁柱中的细胞，即为F4/80⁺CD11b^‑CD11c^‑枯否细胞。第四步、纯度检测，取肝脏机械循环灌注后10^5级细胞重悬于100微升PBS中，加入CD11b FITC、CD11c PE、F4/80 APC流式抗体，4℃避光孵育30‑45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检测细胞表型和纯度。