[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

摘要

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建；二、pack-L和pack-R质粒构建；三、pack-LR质粒构建；四、pT-Kan^r质粒构建；五、同源重组片段ackL-Kan^r-ackR的构建；六、K.oxytoca HD79-01/pKD46菌株构建；七、ackL-Kan^r-ackR转化K.oxytoca HD79-01/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明用于生产2,3-丁二醇。

主权项

高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79‑01的构建；二、ack基因同源左臂片段ack‑L和右臂片段ack‑R的构建：以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79‑01基因组DNA为模板，分别用ack‑L₁、ack‑L₂和ack‑R₁、ack‑R₂引物进行PCR反应；三、pack‑L和pack‑R质粒构建：向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL Taq 5U/μL的DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack‑L和ack‑R，将片段ack‑L和ack‑R分别与pMD18‑T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack‑L和pack‑R；四、pack‑LR质粒构建：以pack‑L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和Bgl II对质粒载体pldh‑L进行双酶切，选用限制性内切酶Xho I和BamH I对质粒载体pack‑R进行双酶切，用T4 DNA连接酶将pack‑R的酶切产物连接到pack‑L质粒载体上，得到重组质粒pack‑LR；五、pT‑Kan^r质粒构建：以pET‑28a(+)为模板，利用Kan‑up和Kan‑down为扩增引物，对Kan^r进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT‑Kan^r质粒；六、同源重组片段ackL‑Kan^r‑ackR的构建：以重组质粒pack‑LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT‑Kan^r和pack‑LR进行酶切，将获得的Kan^r片段插入质粒载体pack‑LR中，构建质粒载体pT‑LKR；选择限制性内切酶Bgl II和BamH I对重组质粒pT‑LCR进行酶切，获得同源重组片段ackL‑Kan^r‑ackR；七、K.oxytoca HD79‑01/pKD46菌株构建：将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79‑01感受态细胞，得到K.oxytoca HD79‑01/pKD46菌株；八、同源重组片段ackL‑Kan^r‑ackR转化K.oxytoca HD79‑01/pKD46：将同源重组片段ackL‑Kan^r‑ackR电转化到K.oxytoca HD79‑01/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79‑02。