[发明专利]一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法

摘要

本发明公开了一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；与现有技术相比，本发明通过转基因技术ipt基因用来转化植物，使得植物内源性细胞分裂素水平升高。在这些转基因植物，ipt基因通过多种启动子驱动，例如组成型的、天然的和诱导型启动子，驱动表达达到增产目的。目前，随着分子生物学的发展和生物技术的广泛应用，利用基因工程对植物基因组在分子水平上进行修饰，定向改变植物的某些性状，为品种的改良开辟了一条新的途径。

主权项

一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T‑nos，CaMV35S启动子驱动Epsps基因作为选择标记；A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS、2ul 10×buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37°C反应1h，65°C终止，胶回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In‑Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS载体两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT‑PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有smaI酶切位点引物PCR扩增，引物序列为：I‑G‑4‑R：5’‑attcgagctcggtacccgggATGGAGCACGGTGCCGTCGC‑3’I‑G‑4‑F：5’ ‑GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA‑3’20mlPCR体系：无菌水                       13.5ul10×tran taq Buffer I (Mg²⁺)  2ul2.5mM/LI‑Q‑1‑R                      0.5ul(10pM)I‑Q‑1‑F                      0.5ul(10pM)dNTP                         2ul(200uM/L)质粒                         1ul约1ug高保真Tad酶                  0.5ul(2U)反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30 cycle，72℃延伸10 min，8℃终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳；回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果和原序列进行比对；ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：I‑Q‑1‑R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGCI‑Q‑1‑F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10 μL去离子水中，再加入到含有In‑Fusion酶的离心管中混匀，PCR仪控制温度37℃ 15min，50℃ 15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2 μL上述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h，均匀涂在含抗生素AMP⁺的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37 ℃ LB液体培养基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态‑80°C保存；D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2ml YEP液体（rif 20mg/ml）培养基中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50ml YEP液体培养基中150rpm/min，28℃培养生长至OD₆₀₀≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml 0.2mmol预冷的CaCl₂溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于‑80℃待用，将5ul目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min, 后迅速置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1ml YEP培养基活化菌体，之后150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工作台中加入100ul YEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan（50mg/ml）的YEP固体培养基平板上，28℃恒温培养2‑3天；所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：（1）工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆菌在含卡那霉素（Kan）50 mg/L、利福平（rif）50 mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；（2）农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA‑5300) 接种到5 mL YEB液体培养基中，28°C，220r/ min 振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮液（OD₅₅₀=0.6‑0.7），加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转移到恢复培养基上，在28ºC的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28ºC暗培养7天，转移至筛选培养基I，含1.5 mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草甘膦增加到3 mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将 II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4‑6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放在培养室中26摄氏度/22摄氏度（白天/晚上）16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土=1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；（3）PCR检测Epsps基因引物：Epsps‑6‑R：5’‑ACATCGAAGTCATCAACCCG‑3’Epsps‑6‑F：5’‑GAATTCGAGCTCATCAGGCA‑3’ZmIPT2基因引物:I‑T‑1‑R: 5' AGATGGTGAGGGCTTTCC 3'I‑T‑1‑F: 5' GCGCGCTATATTTTGTTT 3'20mlPCR体系：无菌水                         13.5ul10×tran taq Buffer I (Mg²⁺)    2ul2.5mM/L上游引物                       0.5ul(10pM)下游引物                       0.5ul(10pM)dNTP                           2ul(200uM/L)质粒                           1ul约1ugTad酶                          0.5ul（2U）PCR 反应条件：94℃，5 min；94℃，30sec；56℃，30 sec；72℃ 1min；33个循环；72℃，10min；8 ℃终止反应；反应完取3ml与2 ul Loading buffer琼脂糖凝胶电泳检测；RT‑PCR 检测：（1）植物RNA的提取取转基因玉米植株新鲜片叶期的幼嫩叶片，置于干净研钵研磨成细粉，操作步骤按照北京全试金试剂公司RNA提取试剂盒说明书进行；采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度；之后‑80°C保存；（2）cDNA的合成取2μL RNA为模板，用Fermentas^®公司反转录试剂盒；冰板上操作，在200mlPCR管中加入检测质量好的200ng玉米总RNA、1ul Anchored oligo(dT)₁₈ 、11.5ul RNase‑free Water，轻轻混回65°C孵育5min，冰上放置2min；加入1ul 10mM dNTPs，4ul 5×ES RT Buffer，0.5ul Ribonuclease Inhibitor(50 units/ul)，1ul EasyScript^® RT，轻轻混匀，42°C孵育30min，85°C 5s使EasyScript^® RT酶失活；合成第一条cDNA；（3）PCR扩增根据基因序列设计引物，扩增片段长度为522bp，以总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增；Epsps基因引物：E‑r‑1‑R：5’‑GGCGACAGCGAGAATC‑3’E‑r‑1‑F：5’‑GGTGAAATCGGAAGACG‑3’20mlPCR体系：无菌水                         13.5ul10×tran taq Buffer I (Mg²⁺)    2ul2.5mM/LE‑r‑1‑R                        0.5ul(10pM)E‑r‑1‑F                        0.5ul(10pM)dNTP                           2ul2ul(200uM/L)质粒                           1ul约1ug高保真Tad酶                    0.5ul(2U)PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应，30个循环，PCR反应结束后，取5 μL混合液加入1 ul Loading buffer，在1%琼脂糖凝胶电泳；所述转ZmIPT2基因后代的功能检测：实验材料：转ZmIPT2基因T2代3个株系I143、I146、I150，方法如下：叶绿素含量检测：（1）玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，剪碎加入丙酮与无水乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至叶片完全脱色为止；（2）将提取液倒入石英比色皿中，在分光光度计663nm和645nm处分别测定叶绿素a和叶绿素b值；计算公式如下：叶绿素a的含量=（12.7A₆₆₃‑2.69A₆₄₅）V/1000*W叶绿素B的含量=（22.7A₆₆₃‑4.68A₆₄₅）V/1000*W叶绿素总含量=（20.2A₆₆₃+8.02A₆₄₅）V/1000*WA_663：、A₆₄₅分别为相应波长时的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重；所测叶绿素单位为mg/g FW；CTK含量检测：液氮取玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，准确称重0.5g；浴加入80%甲醇1ml溶液研磨叶片成匀浆装入10ml离心管；4°C提取4小时，8000r/15min离心，吸取上清至新10ml离心管中，再原管中加入1ml 80%甲醇ml，混合均匀，继续4°C提取1小时；4°C 8000r/15min离心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4°C 8000r/10min离心除去底部残渣，加入等体积石油醚，混合均匀，待分层后去除绿色的石油醚相；甲醇相样品氮气吹干浓缩加入50ul样品稀释液；测定方法见试剂盒：（1）标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品稀释5个梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、6ug/L、3μg/L 和空白孔；（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干；（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；（7）温育：操作同3；（8）洗涤：操作同5；（9）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；（10）终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；（11）测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）； 测定应在加终止液后15 分钟以内进行；计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。