[发明专利]一种用双重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法

摘要

本发明提供了一种免疫捕获双重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV和LMoV的多克隆抗体特异性捕获LSV和LMoV粒子、利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测两种百合病毒LSV和LMoV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。

主权项

一种用免疫捕获双重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：①引物设计根据LSV和LMoV的CP基因序列, 设计LSV和LMoV的特异性正向和反向引物；②免疫捕获1）取100mg复合感染LSV+LMoV的组织，加1mL PBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用pH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV和LSV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV和LSV两种抗体的终浓度分别为1μg/mL和10μg/mL；取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3min; 加入200μL感病组织粗提液，37℃孵育3h；4）弃去抗原液，用 PBST洗3次，ddH₂O洗1次，短暂离心，吸去残液；③双重RT‑PCR1) 在包被过的PCR管中分别加入10 μmol/L的LSV特异性反向引物LSV‑R 2μL、10 μmol/L的LMoV特异性反向引物LMoV‑R 2μL以及ddH₂O 8μL，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2 min；2）双重RT：向上述PCR管中分别加入5×M‑MLV buffer 4μL、10mmol/L 的dNTP混合物2μL、30U/μL的RNase抑制剂0.68μL、200U /μL 的M‑MLV反转录酶0.70μL以及DEPC‑H₂O 0.62μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNAs混合物；3）双重PCR：取一新的PCR管，分别加入上述cDNAs混合物2.0μL、10×PCR buffer 2.5μL、25 mmol/L 的MgCl₂ 2.5μL、2.5mmol/L 的dNTP混合物2.5μL、10μmol/L 的LSV特异性正向和反向引物LSV‑F 和LSV‑R 各0.5μL、10μmol/L 的LMoV特异性正向和反向引物LMoV‑F 和LMoV‑R 各0.5μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶 0.3μL以及ddH₂O 13.2μL，混合均匀后进行双重PCR；上述双重PCR的反应条件为: 94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃～58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30～35个循环，72℃延伸7min，降至常温；④双重PCR反应结束后取10μL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在1×TBE缓冲液环境中，100V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统并观察并记录结果；⑤根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV或LMoV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV。