[发明专利]一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

摘要

本发明涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，属病毒检测领域。本发明针对4种病毒核苷酸保守区序列设计并合成了特异性引物对CMV‑F/R，PMMoV‑F/R，BBWV‑F/R，TMV‑F/R，并对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立能从辣椒组织中同时检测CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病毒复合侵染田间样品的检测方法。本发明提供的多重RT‑PCR检测方法，能够快速、准确又简便和经济的检测出辣椒带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。

主权项

1.一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，4种辣椒病毒为黄瓜花叶病毒CMV、辣椒轻斑驳病毒PMMoV、蚕豆萎焉病毒BBWV和烟草花叶病毒TMV，其特征在于通过以下步骤实现：(1)提取植物总RNA取0.1g新鲜或冷冻的待测辣椒样品在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC‑ddH₂O溶解，‑70℃保存备用；(2)cDNA的合成以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20μL包括：RNA模板2μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，10μmol/L的随机引物2μL，10×RT mix 2μL，Quant Reverse Transcriptase 2μL，RNase‑free ddH₂O 10μL，反应条件：37℃，60min；(3)多重PCR扩增以合成的cDNA为模板，采用下列4对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；第1对引物：CMV‑F/CMV‑RCMV‑F：5′‑AGTCCGTAAAGTTCCTGC‑3′，CMV‑R：5′‑TCATGTCGCCAATATCA‑3′；第2对引物：PMMoV‑F/PMMoV‑RPMMoV‑F：5′‑AGAACTCGGAGTCATCGGAC‑3′，PMMoV‑R：5′‑GAGTTATCGTACTCGCCACG‑3′；第3对引物：BBWV‑F/BBWV‑RBBWV‑F：5′‑AAATATTAAAACAAACAGCTTTCGTT‑3′，BBWV‑R：5′‑TTCAAAGCTCGTGCCATNTYATTKGC‑3′；第4对引物：TMV‑F/TMV‑RTMV‑F：5′‑AGTTGTTGATGAGTTCATGGA‑3′，TMV‑R：5′‑GAGGGAAAAACACTATGCGTTATC‑3′；(4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物取5μLPCR产物在浓度为15g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果，根据电泳条带图判定病毒种类，若扩增产物中出现170bp大小的条带，则样品中含有CMV；若扩增产物中出现576bp大小的条带，则样品中含有PMMoV；若扩增产物中出现390bp大小的条带，则样品中含有BBWV；若扩增产物中出现796bp大小的条带，则样品中含有TMV；所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CMV‑F/R 0.2μM，PMMoV‑F/R 0.2μM，BBWV‑F/R 0.1μM，TMV‑F/R 0.4μM；所述多重PCR扩增反应体系为50μL：包括反转录产物1.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺ 3.0μL，10μmol/L的引物CMV‑F、CMV‑R各1.0μL，10μmol/L的引物PMMoV‑F、PMMoV‑R各1.0μL，10μmol/L的引物BBWV‑F、BBWV‑R各0.5μL，10μmol/L的引物TMV‑F、TMV‑R各2.0μL，2.5mmol/L的dNTPs 2.0μL，2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.6μL，无菌ddH₂O 31.9μL。