[发明专利]实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法

摘要

本发明提供了一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，旨在提供一种操作简单、时间短、准确率高、环保该方法依次包括下述步骤：1)引物的稀释备用；2)样品的前处理取1g试样；3)DNA的提取；4)磁珠法提取样品DNA；5)PCR反应液的配制；6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95℃、4min1个循环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环，采集荧光；7)数据处理；属于化学检测技术领域。

主权项

一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)引物的稀释每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解，于‑20℃冰箱保存备用；2)样品的前处理取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中；3)DNA的提取样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μl裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A 5μl，振荡混匀；置于70℃金属浴中10‑30分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提取；4)磁珠法提取样品DNA取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μl，连接缓冲液600μl，磁珠60μl；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μl；G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μl；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μl；取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μl；将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取；5)PCR反应液的配制每管PCR管中分别加入2x荧光定量预混试剂彩色版10μl、正、反引物各0.5μl及无RNA酶ddH2O 7μl；往上述含有反应液的PCR管中加入2μl提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心3～10秒，立即进行PCR反应；6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95℃、4min1个循环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环，采集荧光；7)数据处理将数据同步至电脑上，选择“定性检测”对试样进行分析。