[发明专利]一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，对已知的370种CD抗体对人胚胎干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞进行筛选，筛选出的其中一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化节细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，从而用于临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。

主权项

一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)利用Talen技术，建立Brn3‑GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3‑GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化；(2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白；(3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞；(4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面；(5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养后，将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系；在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。