[发明专利]一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法

摘要

一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤(1)斑马鱼脑部组织蛋白样品的制备；(2)SDS凝胶电泳；(3)转膜；(4)封闭；(5)一抗、二抗孵育；(6)显色反应；(7)计算M3受体变化结果。本发明克服了传统斑马鱼M3受体检测受制于无针对性抗体而无法使用蛋白质免疫印迹技术之缺陷，首次提出使用p38MAPK磷酸化水平从而测定斑马鱼M3受体蛋白含量变化，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；同时本发明操作简单快捷、特异性高、成本低，本发明从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终能够实现对水质的实时在线评估与监测。

主权项

一种基于测定p38MAPK蛋白磷酸化水平表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）蛋白样品提取制备：取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；（2）SDS凝胶电泳：制备电泳凝胶，进行SDS‑PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10℃；（3）转膜：将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4℃；（4）封闭：放入5%的脱脂奶粉中封闭1h，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；（5）一抗、二抗孵育：用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4℃孵育盒中过夜，次日从冰箱里拿出来室温孵育1h；然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min；期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min；（6）显色反应：化学发光剂检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果；（7）计算结果：通过步骤（6）得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化；所述一抗为针对p38MAPK的兔抗磷酸化p38MAPK抗体；所述二抗为针对p38MAPK的HRP标记的羊抗兔IgG。