[发明专利]一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法，包括如下步骤(1)寡雄腐霉悬浮液制备，(2)包含目的基因载体的农杆菌菌液制备，(3)农杆菌菌液侵染寡雄腐霉悬浮液，(4)恢复培养，(5)转化子筛选。本发明的方法采用液体振荡共培养的方式提高转化率，液体恢复培养的方式增加了转化率，简化了操作流程，降低了污染率，并且方便挑取抗性单菌落进行纯化培养与鉴定。本发明提供了一套简单便行并且高效稳定的农杆菌介导寡雄腐霉的遗传转化方法，为利用该生防真菌的功能基因及对其性状进行改造提供了研究途径。

主权项

一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：(1) 寡雄腐霉悬浮液制备：用诱导培养基IM冲洗平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌丝，使寡雄腐霉孢子菌丝悬浮液的浓度为1×106～7个/mL；(2) 包含目的基因载体的农杆菌菌液制备：挑取农杆菌单克隆活化扩大培养后，收集菌体用诱导培养基IM重悬稀释菌体至浓度OD600为0.3～0.7；(3) 农杆菌菌液侵染寡雄腐霉悬浮液：将上述农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液混合共培养，农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液比例为1～10 ：1，培养条件为避光，25℃, 60rmp，培养时间24h～96h；(4) 恢复培养：向共培养后的菌液中加入细菌抗生素， 26℃，120rmp，培养24～48h；(5) 转化子筛选：离心收集恢复培养后的菌体，用PDB重悬，涂布添加有抗性选择压的PDA平板，26℃培养；挑取抗性单菌落接种于抗性选择压PDA平板26℃培养至菌丝生长铺满平板，收集菌体用于阳性检测；步骤（1）和（2）所述的诱导培养基IM为：PDB+300 μ M 乙酰丁香酮，pH值为5.0。