[发明专利]一种杉木原生质体的制备及纯化方法有效
| 申请号： | 201610708676.5 | 申请日： | 2016-08-23 |
| 公开（公告）号： | CN106318896B | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 林二培;唐佳妮;楼雄珍;黄华宏;童再康 | 申请（专利权）人： | 浙江农林大学 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 11498 北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 王加岭 |
| 地址： | 311300 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种杉木原生质体制备及纯化方法。选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解2‑4h；用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，得到纯化的杉木原生质体。本发明得到杉木叶片原生质体的产量为1.8×10 | ||
| 搜索关键词： | 原生质体 杉木 茎段 叶片 离心管 酶解液 清洗液 细胞筛 酶解 沉淀 过滤 清洗 叶片原生质体 原生质体制 原生质体重 滤液合并 水平摇床 幼嫩茎段 抽真空 组培苗 放入 分轮 悬液 预冷 重悬 黑暗 重复 | ||
【主权项】：
1.一种杉木原生质体制备及纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：/n1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和/或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解，酶解温度为25～27℃，酶解时间为2h；/n2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片和/或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀，得到纯化的杉木原生质体，/n所述酶解液按如下方式制备：将1.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，1％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl溶于20mM MES，水浴10min，冷却后加入10mM CaCl
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