[发明专利]血液中循环肿瘤细胞的检测方法

摘要

本发明涉及肿瘤细胞领域，具体为一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是按如下步骤依次实施a. 全血处理；b. 细胞全富集；c. 细胞固定；d. 封闭及抗体孵育；e. 扫描。本发明无分离，全富集，精度高。

主权项

一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：a. 全血处理：向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；200RCF下离心5min，吸除上清液，保留细胞；向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；b. 细胞全富集：加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3‑氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；c. 细胞固定：吸除FPBS，向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于‑20℃环境中静置10min；吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；d. 封闭及抗体孵育：向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液，在4℃环境下避光孵育1hour；封闭液的配制方法是：首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉，然后向脱脂奶粉中加入Tween‑20使Tween‑20的浓度为0.02%(V/V)，即为封闭液，m/V指溶质质量/溶液体积，V/V指溶质体积/溶液体积；吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST（即含0.02%Tween‑20的PBS）清洗4次，每次5min；向500μL封闭液中加入2μL的anti pan cytokeratin和3μL的CD45，anti pan cytokeratin即抗广谱细胞角蛋白，CD45即白细胞共同抗原，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI，DAPI即4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚，常温避光孵育30min；e. 扫描：吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描。