[发明专利]脐带间充质干细胞上清液的收集方法

摘要

本发明涉及脐带间充质干细胞上清液收集方法，去除了易致敏的血清，加入了能够增强细胞活力的人参皂苷，从而增加了细胞因子的分泌量，人参具有补气益津的作用，其主要成分人参皂苷在生物学中具有类生长因子作用，可以促进细胞增殖，促进生长因子合成。创面的愈合是一个复杂而有序的过程，在机体的调控下，炎性细胞、多种细胞因子等诸多因素相互协调，一起参与创面愈合。人参皂苷自身可以促进细胞增殖，增强细胞活力，它的添加使上清液治疗难愈性创面的效果更加明显。

主权项

一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：方法由下列步骤组成⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来；⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5‑1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO2培养箱中干燥1小时；⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代；⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3‑5分钟后，用血清终止消化；⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞；⑽将间充质干细胞按照8000个/cm2进行接种，约每3天传代一次；⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养；⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心；⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，‑80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，‑20℃冷冻保存。