[发明专利]一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用

摘要

本发明公开了一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用。本发明在EV71型病毒基因组的3D蛋白编码区后面添加B型肝炎病毒的link序列，而后将EGFP基因连入link与EV71型病毒3’非翻译区之间，从而构成荧光蛋白标记的病毒基因组，该结构不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，产生的EGFP蛋白也不影响子代病毒颗粒组装。转染RD细胞拯救出表达EGFP基因的重组病毒。该病毒能够高效表达EGFP基因，病毒生长曲线与野生病毒株相似，插入的EGFP基因在连续传代过程中较为稳定。该荧光标记病毒株可用于借助酶标仪建立中草药或中草药单体抗病毒的高通量筛选技术(平台)。

主权项

1.一株表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒的制备，具体步骤如下：(1)携带EGFP基因的全长感染性克隆的构建在EV71型病毒基因组的第7218位碱基后插入link序列，EV71型病毒基因组的第1‑7218位如SEQ ID NO.1所示，link序列如SEQ ID NO.2所示，link序列之后插入自带终止密码子TTA的EGFP基因，自带终止密码子TTA的EGFP基因序列如SEQ ID NO.3所示，最后连入EV71型病毒3’端非翻译区，即第7218位以后序列，第7218位以后序列如SEQ ID NO.4所示，在连接好的基因组序列的5’端添加Sac I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点；通过PCR的方法获得各个片段，相邻片段间有20bp的相同碱基，将PCR产物与用SacI和Not I线性化的pEGFP‑N1载体等比例混合，用EZfusion同源重组酶处理后转化大肠杆菌，即获得重组EV71型病毒基因组；(2)重组病毒的拯救用大提试剂盒提取pEGFP‑N1‑EV71‑link‑EGFP质粒，将大提的质粒转染至生长为70％的RD细胞培养板中，6孔板，转染剂量为2.5μg，6h后换为含有质量分数为3％胎牛血清的DMEM维持液，并将转染的六孔板置于37℃、5％CO₂孵箱中培养72h，使质粒能够在细胞内更有效的转录病毒基因组RNA；72h后换为2％的DMEM维持液，并将细胞转移到33℃、5％的CO₂孵箱中培养72h；在33℃、5％CO₂培养3天后的细胞，以1:3的比例传代到细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养48h；待细胞融合达到80％时，换为2％的DMEM维持液，转入33℃、5％CO₂孵箱中进行培养，3天后收取细胞和上清，经37℃与‑80℃反复冻融3次，混合后于3000r/min离心5min，0.45μm的滤膜过滤，即得表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒，命名为EV71‑link‑EGFP。