[发明专利]一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法。构建得到一种基因工程酵母质粒载体，该质粒载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中一个启动子GAL10能够将外源蛋白定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因的蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，酵母表面的蛋白可以用于蛋白功能研究，胞内荧光强度指示酵母数量而达到的高效、简便、经济的目的以及用于胞内蛋白研究。

主权项

一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α‑半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA‑1αL I domain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA‑1αL I domain胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP；分离小鼠LFA‑1αL I domain胞外域基因片段四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL Id‑wGFP，分别为pDV3‑intre‑muαL Idwt‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/T208I‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的α‑半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；小鼠LFA‑1αL I domain胞外域为四个，所述的wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP为四个，分别为pDV3‑intre‑muαL Idwt‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/T208I‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；(2)双通道蛋白表达工程酵母载体的验证：将步骤(1)所述的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP以PEG/LiAc方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，通过流式细胞仪检测小鼠LFA‑1αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达。