[发明专利]利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法

摘要

本发明公开了一种利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，属于细胞结构分析领域。本发明通过对拟南芥根进行横向冰冻切片后，得到仅含有根冠部位的根部横切，10µm的切片厚度大大降低了显微镜Z轴分辨率对成像真实性的影响；通过优化显微拍摄的条件，减小拍摄步进至小于0.4µm，降低Pinhole值以确保计算的光学切片厚度小于0.8µm，保证了画面的细腻程度，扫描范围包含了一个中柱细胞从上至下的全部结构；可以得到更为细致的显微镜成像图片，有效减少了非焦平面杂散光对图像的影响，提高了图像的分辨率，保证了研究对象结构真实性的呈现；利用这种三维图像重组技术，能够更加直观、准确的确定细胞内部内质网结构。

主权项

1.利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存；（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块2~3cm的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片；（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜 LSM 510进行拍照；（4）Image J图像处理在Image J中打开连续的纤维切层图像，使用Image → Duplicate…按钮挑选感兴趣的图层，另存为命名后的文件以备后期分析使用；如果感兴趣的是一组图层，则需使用Image → Stacks → Z Project →Projection挑选出相邻的多层图像；区域相对荧光强度的分析：使用多边形框选按钮框选出感兴趣的目标区域，使用Analysis → Measure 得到此区域的平均荧光强度；如果要测量同一坐标线上各个点的荧光强度，则使用Analysis → Plot Profile 完成；使用Process → FFT → Bandpass Filter 进行图像的过滤处理，一般将Filter Large Structure Down to 设定为40；使用Process → Filters → Gaussian Blur → Sigma设定高斯变换参数，进行数据平滑处理，一般Sigma设为1；（5）三维细胞结构生物影像显微重组在Imaris 6.2软件切面视图中打开图像文件，在主工具栏中选择Surpass模式，打开Display Adjustment的高级设置，阈值范围在45‑200之间；研究对象在视图区域内显示；创建一个文件，编辑，改变指针模式为Select，按住Shift键，并点击鼠标在想要的第一个位置上，插入点，移动鼠标至下一个点，按住Shift键，并点击鼠标插入下一个点，如此继续，绘制显微切层上研究区域的轮廓；从上到下，完成所有囊括研究对象的显微切层图像单独多边形的绘制；使用Calculate Surface计算研究对象的轮廓表面，然后点击Create Surfaces按钮创建表面对象；点击Mask Properties中的Mask All按钮，将其它不感兴趣的表面对象区域掩盖，得到了只有研究对象细胞的三维图像文件；依照上面的方法将所有感兴趣的细胞进行三维图像重组：依次打开所需的文件遮罩层，点击SnapShot调整位置后进行拍照、录像后进行分析。