[发明专利]一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法

摘要

本发明涉及一种基于等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，属于生物信息技术领域。所述鉴定方法对多肽两端进行同位素标记后的蛋白质酶解产物，在使用液相色谱‑质谱联用进行分离和检测后，在使用数据库搜索的方法进行鉴定时，通过构建包含两种标记形成的肽段的所有碎片离子的肽段理论谱图，并与实验质谱图进行匹配，实现对多肽的鉴定，进而鉴定得到蛋白质，提高了多肽和蛋白质鉴定的效率，可用于已知数据库蛋白质样品的高效鉴定。

主权项

一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：所述方法步骤如下：(1)对蛋白质进行如下处理：变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸‑C进行酶切，形成多肽；(2)使用化学/代谢标记对多肽N端的α‑氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；在进行标记时，将多肽分成等量的两份，一份多肽中的N端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有重同位素的标记试剂进行标记，另一份多肽中的N端采用含有重同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记，标记完成的两份多肽间轻重同位素标记的相同肽段的分子量相差0Da～‑0.1Da；化学标记使用的标记试剂为与氨基发生反应的化学试剂；进行代谢标记时，通过在细胞培养液中加入含有不同轻重同位素的赖氨酸和/或精氨酸，并且使含有待鉴定蛋白质的细胞在所述培养液中传代6次～8次；所述不同轻重同位素为：12C、13C、14N、15N、H或氘；(3)将标记后的两份多肽混合，使用一维或者二维液相色谱‑质谱联用进行分离和鉴定，获得肽段质荷比信息；在进行PD,Pfind以及Mascot数据库搜索和肽段匹配时，根据同位素标记引起的N端轻标和重标b离子以及C端轻标和重标y离子与实验质谱图匹配程度计算候选肽段的得分值，进行多肽和蛋白质鉴定；对质谱采集到的每一条肽段的质谱图进行同样的操作，从而实现对蛋白质的鉴定。