[发明专利]一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法

摘要

本发明属于植物基因工程研究技术领域，具体涉及一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法。该方法包括：多基因植物表达载体的构建、载体的鉴定、载体转化农杆菌、制备转化液、浸花法转化油菜、筛选、鉴定、自交获得纯合体等步骤；所述多基因植物表达载体中，包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因，具体排列顺序为：LB‑HYG–GUS‑BAR‑ICE1‑LOS5‑CBF3‑ABAR‑NCED3‑RB。本发明通过优化抗性基因组合，并将多个抗逆关键节点基因构建于同一表达载体中。在将该载体转化植物体后，一次转化即可使植物体能够同时适应多种逆境条件，提高植物的综合抗逆能力，表现较好的生产应用价值。

主权项

一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）多基因植物表达载体的构建，构建pABA‑oriT载体，该载体的T‑DNA中的克隆基因表达盒包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；所述5种抗逆功能基因包括：2个ABA合成相关基因NCED3、LOS5，1个ABA信号途径相关基因ABAR，2个抗冻调节基因ICE1、CBF3；所述3种选择标记基因包括潮霉素抗性基因HYG、GUS和草铵膦抗性基因BAR；5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA‑oriT载体T‑DNA区的具体排列顺序为：LB‑HYG–GUS‑BAR‑ICE1‑LOS5‑CBF3‑ABAR‑NCED3‑RB；（2）对步骤（1）中所构建的重组表达载体的鉴定，确保5种功能基因共存于同一表达载体中；（3）对步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体转化农杆菌，制备转化液；（4）采用农杆菌介导的浸花法转化油菜，转化后，继续培育至成熟，按单株收获种子；（5）转化体的筛选和鉴定，将步骤（4）中所收获油菜种子播种，依次进行Basta抗性、潮霉素抗性筛选，并对双抗性植株进行PCR鉴定；（6）转化体自交获得纯合体，对步骤（5）中筛选、鉴定正确的转化体继续培养，于花期时套袋，使其自交，收获单株种子；对收获的种子继续种植，同步骤（5）操作，继续进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定，并对鉴定正确的转化体继续自交，并最终获得转化纯合体，即为具有综合抗逆特性的转基因油菜。